第三章沉淀反应技术..docVIP

第三章 沉淀反应技术 （Precipitation reaction technique） 概述 可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他来源的蛋白质、多糖质、类脂体等）与其相应的抗体相遇后，在电解质参与下，抗原抗体结合形成白色絮状沉淀，出现白色沉淀线，此种现象称为沉淀反应。沉淀反应中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,与沉淀原发生反应的抗体称为沉淀素（precipitin）。沉淀反应的发生机制与凝集反应基本相同。不同之点是：沉淀原分子小，单位体积内总面积大，故在定量试验时，通常稀释抗原。 沉淀反应主要包括有环状沉淀反应、絮状沉淀反应和琼脂扩散反应。 环状沉淀反应是最早的沉淀反应，目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。主要是用已知的抗体诊断未知的抗原。 絮状沉淀反应是将抗原与血清在试管内混合，在电解质存在的情况下，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状沉淀凝聚物，此法通常用于毒素与抗毒素的滴定。 琼脂凝胶免疫扩散（Agar－gel immunodiffusion）是沉淀反应的一种形式，是指抗原抗体在琼脂凝胶内扩散，特异性的抗原抗体相遇后，在凝胶内的电解质参与下发生沉淀，形成可见的沉淀线。这种反应简称琼脂扩散。 抗原抗体扩散使用的凝胶种类很多，除琼脂外还有明胶、果胶、聚丙烯酰胺等，因此总的名称叫免疫扩散（Immunodiffusion 简写为ID）。琼脂扩散是免疫扩散中的一种方法。 琼脂扩散的原理是：物质自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。我们所使用的1％～2%的琼脂凝胶，琼脂形成网状构架，空隙中是98％~99%的水，扩散就在此水中进行。1％~2%琼脂所形成的构架网孔较大，允许分子量在20万以下甚至更大些的大分子物质通过，绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在20万以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处发生沉淀，此沉淀物因颗粒较大而不扩散，故形成沉淀带。 一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带，复合物抗原中的多种抗原抗体系统均可根据自己的浓度、扩散系数、最适比等因素形成自己的沉淀带。本法的主要优点是能将复合的抗原成分加以区分，根据沉淀带出现的数目、位置以及相邻二条沉淀带之间的融合、交叉、分枝等情况，就可了解该复合抗原的组成。 二、环状沉淀反应 以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Ascoli氏反应。 （一）材料与试剂 1．已知炭疽沉淀血清，购买自生物制品所。 2．待测炭疽沉淀抗原 3．试管5mm×50mm、滴管 4．0.3%石炭酸生理盐水 （二）操作方法 1．待测抗原的提取 （1）取可疑为炭疽而死的病畜的实质脏器1g，放入试管或小三角烧瓶中，加生理盐水5ml～10ml，煮沸30min～40min，冷却后用滤纸过滤得清澈的液体，即为待测抗原。 （2）如病料是皮张，可采用冷浸法。将样品高压灭活后，剪成小块并称重，加约5倍的0.5%生理盐水，室温浸泡18h～24小时，滤纸过滤，即为待检抗原。 2．取试管5支（5mm×50mm）置于试管架上，编号。第1、2试管内加炭疽沉淀血清，第3、4试管内加正常血清，第5管内加待检抗原，分别用毛细滴管加至4mm～5mm。 3．第1、4、5试管轻轻叠加等量缓冲液，第2、3试管轻轻叠加等量待检抗原。为防止上下两界面破坏，可将小试管从试管架取出，微倾斜，沿试管壁加入缓冲液或抗原。 4．在试管架上静置数分钟，观察结果。 （三）结果判定 第2管内两液界面出现白色环状沉淀带，其余管无此种沉淀带判为阳性。 （四）注意事项 1．反应物必须清澈，如不清澈，可离心，取上清液或冷藏后使脂类物质上浮，用吸管吸取底层的液体。 2．必须进行对照观察，以免出现假阳性。 3．采用环状沉淀反应，用以沉淀素效价滴定时，可将抗原做100×，1 000×，2 000×，4 000×，8 000×等稀释，分别叠加于抗血清上，以出现环状沉淀的最大稀释倍数，即为该血清的沉淀素效价。 三、琼脂免疫扩散试验 （一）材料与试剂 1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。 （二）操作方法 1．称取一定量的琼脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。 2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。自然冷却。 3．根据要求（孔径即孔的直径，孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。也可直接用组合打孔器打孔。现在一般多打成梅花形孔图。 4．挑出孔内琼脂，注意不要挑破孔缘。 5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。 6．以毛细