动物细胞培养技术课件.ppt

干细胞鉴别和分离干细胞的一些常用标志一些分子标志物已经被用来给不同的干细胞群体定性。尽管这些早期标志物的作用还有待确定，细胞独特的随发展阶段而变化的表面标志为初步鉴定和分离干细胞提供了有用的工具。胚胎干细胞标记物:Oct-4 ,SSEAs (特异性胚胎抗原)造血干细胞标记物:CD34,CD133,Sca-1 (干细胞抗原1, Ly-6A/E), ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2)间质/基质干细胞标记物 : STRO-1神经干细胞标记物：Nestin, PSA-NCAM (多唾液酸-神经元黏附分子), p75 Neurotrophin R (NTR) 肿瘤细胞培养 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先因为癌细胞是比较容易培养的细胞，当前建立的细胞系中癌细胞系最多。另外肿瘤是对人类威胁最大的疾病。 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。 培养中的肿瘤细胞具有以下突出特点：（－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜下癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则。 （二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。肿瘤细胞能自泌或内泌性产生促增殖因子，在低血清中（2％～5％）仍能生长。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。（三）永生性永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。 （四）浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。（五）异质性构成同一肿瘤的细胞在增殖能力、遗传性、起源、周期、活力等性状上存在异质性。处于瘤体周边区的细胞获得血供多，增殖旺盛，中心区有的细胞衰老退化，有的处于周期停滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells），只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖。 （六）细胞遗传大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。 二、培养方法 肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。  1．取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜超过24小时。 2．培养基：肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，肿瘤细胞对培养环境适应性较大，但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。培养肿瘤细胞加血清和相关生长因子培养更易成功。 3．成纤维细胞的排除：原代培养时肿瘤细胞常与成纤维细胞混杂生长，而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终可能抑制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。 三、成纤维细胞排除法（略） 四、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况： 完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡； 传数代后细胞增殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，