蛋白质的沉淀反应课件.pptVIP

* * 实验一 蛋白质的沉淀反应 一、目的 二、原理 在水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为 1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。 两类。 （1）可逆的沉淀反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属盐或某些 有机酸的反应都属于此类。 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 三、操作 1．蛋白质的盐析即中性盐沉淀蛋白质： 取1个离心管加入5mL蛋白质溶液和5mL饱和硫酸铵溶液，混匀后静置10min则球蛋白沉淀析出。2000r/min离心5min，将上清液转入另一离心管，向沉淀中加少量水， 观察沉淀是否溶解，为什么？ 向另一离心管的上清液添加硫酸铵粉末，边加边搅，直至粉末不再溶解达到饱和为止，此时析出的沉淀为清蛋白。2000r/min离心5min，倒去上清液，向沉淀中加少量水，观察沉淀是否溶解。 2．重金属盐沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2滴3%硝酸银溶液，振荡试管，观察沉淀的生成. 3．有机酸沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入1mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。 4．有机溶剂沉淀蛋白质： 取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。 5、乙醇引起的变性与沉淀： 取3支试管，编号。依下表顺序加入试剂： 2.0 2.0 2.0 95%乙醇 — — 1.0 pH4.7缓冲溶液 1.0 — — 0.1mol/L 盐酸溶液 — 1.0 — 0.1mol/L氢氧化钠溶液 1.0 1.0 1.0 蛋白质溶液 3 2 1 试管号 试剂（mL） 振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水4mL，然后在第2，3号管中各加1滴甲基红，再分别用0.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。 四、结果： 1.盐析： 球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中析出，清蛋白在饱和硫酸铵溶液中析出。 (5ml) (5ml) ? *