微生物实验-数革兰式染色.docxVIP

细菌的革兰氏染色与显微观察实验原理革兰氏染色原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结，当用乙醇处理时，由于脱水而引发网状结构的孔径变小，通透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌的细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。显微镜成像原理：现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常?被称为复式显微镜。显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。在载玻片与镜头之间加滴镜油主要是为了增加照明亮度和增加显微镜的分辨率。以油代替空气作为光的传播介质，减少光线的折射或全反射，使观察到的像更加清晰。实验器材菌落：大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物。溶液或试剂：蒸馏水、碘液、结晶紫染色液、95%酒精、番红染色液、香柏油。仪器：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、镊子、擦镜纸。实验步骤革兰氏染色：涂片取出载玻片，点燃载玻片，燃尽载玻片上的酒精和灭菌，在中间轻轻点一小滴蒸馏水，用接种环在试管的斜面培养基上，轻轻挑取少量菌体，整个过程试管口都要处在酒精灯的上方，而且速度要快，以防污染培养基。然后在载玻片的小水滴以转圈的动作涂片，待水滴混浊后停住，等其干燥、固定。初染滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于菌落上，染色1～2min?，倾去染色液，有细水从载玻片上方向下冲洗，至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。脱色将载玻片上面的水甩净，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管加95%的酒精脱色，直至流出的酒精刚好不出现蓝色，立即用水冲净酒精，将载玻片上水甩净。 复染用番红液复染约1～2min，水洗，然后再吸水纸吸干镜检：在低倍镜下寻找要观察的细菌菌落（在不停地移动载玻片，若感觉到有红色阴影，立刻停止，调整倍数，若不是菌落，继续找），将镜筒升高，然后转换到油镜。在样品区域加滴香柏油，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。实验结果绘出在油镜下观察到的三种菌的形态思考题为什么要求涂片干燥后才能用油镜观察？制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？因为如果涂片不干燥，油滴就无法在玻片与油镜之间聚合，影响到观察效果；在挑取细菌、涂片、脱色这些环节应该特别注意。涂片在染色前为什么先进行固定？固定时应注意什么问题？如果不进行固定，那在染色和冲洗时，玻片上的细菌会被冲走；在固定时，是要慢慢晾干，如果得确要加快速度，可以处于酒精灯火焰上部远处稍微烘几下，切忌烘得玻片升温，否则有可能会破坏细菌生命形态。进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?如果菌龄太老了，细胞壁的通透性会改变了，使结晶紫染液可以脱色透出，甚至会出现菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应，这样就无法检验了。哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？在干燥时，如果要烘干，只能使玻片的温度升高一点点；涂片时，一定要涂得均匀，使细菌与营养体分离，菌落不会重叠；脱色环节，一定要控制好脱色的时间，不能过长，也不能过短，脱色过度会将阳性菌误染为阴性菌，脱色不够则将阴性菌误染为阳性菌。假设微生物实验室中有一种待测细菌，设计一个方案测出该细菌是G+还是G-。经挑取细菌，涂片、干燥、初染、媒染、脱色、复染后，进行镜检，如果细菌呈紫色则是阳性细菌，如果呈红色则是阴性细菌。用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间为什么要滴加油？滴加什么油。只能在用油镜观察时，油镜可以碰到油，其他的物镜绝不能碰到油，在观察时应该遵循从低倍镜到高倍镜的原则；在载玻片和镜头之间要滴加香柏油，以香柏油代替空气作为光的传播介质，减少光的折射与散射，让成像效果更佳。影响显微镜分辨率的因素有哪些？物镜、目镜的倍数，被测样品的透光性，光线的强度。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？如果在高倍镜及油镜下观察时，物镜与玻片靠得很近，如果误操作粗调节器，可能会压碎载玻片和划花物镜，造成仪器的损坏。实验总结在挑取细菌时，不用太用力，否则会挑取过多的营养体，使得在涂片时难以使细菌与营养体充分分离，导致营养体遮住了细菌。在进行镜检时，一定要先在低倍镜下找到菌落，如果在高倍镜下找，那真得是在考人品了。在低倍镜下找