实验四+PCR及电泳技术课件.pptVIP

实验4 PCR及电泳技术 1. PCR的基本原理 PCR基本原理 类似于DNA的体内复制。在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR的基本步聚　 　1、变性 (Denaturation) ：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA 。 2、退火 (Annealing) ：当温度突然降低时，反应体系中引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。 3、延伸 (Extension )：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)及Mg2+存在条件下，5’→3’的聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95℃) PCR Cycle - Step 2 –Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences PCR Cycle - Step 3 - At 72 ℃ Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated End of the 1st PCR Cycle –Results in two copies of target sequence Target Amplification PCR扩增程序: 94℃, 300S 94℃, 60S 55℃, 60S 72℃, 60S 72℃, 7min 2. 电泳技术 电泳分离的原理 电泳(electrophoresis)溶液中带电粒子(离子)在电场中移动的现象。 1、电荷效应 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的目的。 2、分子筛效应 不同的分离介质形成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反则慢。 3、待分离生物大分子的性质 一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 4、电场强度 电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。 电泳技术的种类 按支持介质的不同可分为： ⑴ 纸电泳(Paper electrophorisis) ⑵ 醋酸纤维薄膜电泳(Cellulose Acetate electrophoresis) ⑶ 琼脂凝胶电泳(Agar Gel electrophoresis) ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) ⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)。 琼脂糖凝胶电泳 * Target Sequence Target Sequence PCR原理示意图 ① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 5’ 3’ 3’ 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 5’ 3’ 3’ 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 加热94℃ 引物酶 ② 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； Target Sequence Target Sequence Primer 1 Primer 2 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 引物酶 3’ 5’ 3’ 5’ TAGCG