2016-4基因突变的应用方案.ppt

三、代谢控制育种 通过特定突变型的选育，达到改变代谢通路、降低支路代谢终产物的产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。 反馈调节 是指当合成代谢途径的终产物或分支代谢途径的终产物过量合成时，抑制合成代谢途径的关键酶的活力或其酶合成。反馈调节分为反馈抑制和反馈阻遏。 （一）直线式代谢途径中的反馈抑制 （二）分支代谢途径中的反馈抑制 ①优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成，浓度过量后，抑制自身合成途径，使代谢转向合成另一个终产物。（例如黄色通杆菌优先合成谷氨酸，当谷氨酸过量后，使代谢转向合成天冬氨酸。） ②协同反馈抑制：分支途径中两个或两个以上的终产物单独存在时不能抑制共同途径中第一个酶，只有几个终产物同时过量存在时，才能抑制此酶。 ③合作反馈抑制：分支途径中末端产物单独存在时仍有微弱的抑制作用，当几个末端产物共同存在时抑制作用增强。 （AMP和GMP单独存在都对磷酸核糖焦磷酸酶有抑制，但共同存在时，其抑制作用大于两个单独存在时的和。） ④累积反馈抑制：分支途径中每一末端产物单独存在时，只是部分地抑制共同途径中地第一个酶。各个终产物地抑制作用互不影响，只有同时过量存在时，才使酶活力完全受到抑制，并且抑制的总百分数等于各单独抑制的百分数的和。 ⑤同工酶调节：一个共同途径的起始反应受两个或两个以上的酶所催化。这些酶催化同一个反应，但起分子结构不同。 ⑥顺序反馈抑制：分支代谢途径中几个末端产物抑制分支点后第一个酶，使分支点产物累积，结果分支点产物又反馈抑制了共同途径中的第一个酶，最后使整个代谢途径停止。 1、 组成型突变株的选育 组成型突变株:是指操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶、或不受终产物阻遏的调节突变型 。 （三）代谢调节控制育种 筛选方法及实例: （1）限量诱导物恒化培养 将野生型的菌种经诱变后移接到低浓度诱导物的恒化器中连续培养。由于该培养基中底物浓度低到对野生型菌株不发生诱导作用，所以诱导型的野生型菌株不能生长，而突变株由于不经诱导就可以产生诱导酶而利用底物，因而很快得以生长成为组成型菌株。培养过程正确控制培养时间，使组成型突变株得以繁殖，而诱导型菌株则被淘汰。 例如在低浓度乳糖恒化器内连续培养大肠杆菌，其中组成型突变株不要加诱导物也能合成半乳糖苷酶，把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖作为能源和代谢原料，迅速得以生长，但野生型菌株因缺少诱导物和相应的酶，不能利用乳糖而淘汰。 （2）循环培养 要解除诱导的菌株，移接到含有诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养。由于组成型突变株在两个培养基上都能产酶，生长逐渐占优势。 先诱导，将培养物移接到含诱导物培养甚中培养，此时组成型菌株立即开始生长，而诱导型菌株须经一段停止时间才开始生长，只要细心控制在含诱导物培养基中培养时间，反复交替培养，组成型逐渐占优势，诱导型却被淘汰。 （3）鉴别性培养基的利用 如将诱变孢子悬液涂布在甘油作唯一碳源的平板上，培养后长出菌落。然后在菌落上喷上O-对硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），组成型成黄色，诱导型呈白色。这是由于组成突变株在没有诱导底物存在时仍能产生β-半乳糖苷酶，将无色试剂水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑选。此方法为目测法，可免去上述几种方法的浓缩富集过程。 （4）筛选 经诱变剂处理后的菌体移接到含有诱导能力低，但能作为良好碳源的诱导物的培养基中培养，突变体能良好生长，野生型不能生长。 二 抗分解调节突变株的选育 抗分解调节突变就是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。在实际生产中，最常见的是碳源分解调节、氮源分解调节和磷酸盐分解调节（尤其在次级代谢）。 （例如以甘油和铵盐培养产气杆菌时，能产生组氨酸，当采用葡萄糖代替甘油作碳源，则酶的合成受抑制。易迅速利用的碳源对次级代谢的影响也很大，特别对抗生素。） （一）解除碳源调节突变株的选育 筛选方法与实例： 1．循环培养法 将诱变剂处理后的微生物移接到快速利用的碳源和慢速利用的碳源培养基上进行交替培养，然后筛选需要的突变株。 2．特殊氮源 用葡萄糖为碳源，受阻遏酶的底物作为唯一氮源配制成培养基，连续移接诱变后的产气杆菌，可以选出不受葡萄糖阻遏的组氨酸酶突变株。由于野生型菌株合成组氨酸酶被葡萄糖阻遏，而突变株则可产生组氨酸酶，能迅速生长形成菌落。 3．葡萄糖结构类似物