!02=DNA重组技术=2013课件.ppt

1223.123 植物基因工程原理 DNA重组技术又称为基因工程（gene engineering）或分子克隆(molecular cloning)。是指通过一系列的实验技术，最终将一个生物体中的遗传信息(DNA)转入另一个生物体。 1973年由美国加利福尼亚的 S.Cohen和N.Boyer首次完善DNA重组，并得到验证。 Contents of Chapter 2 §2 常用工具酶 一、核酸酶（nuclease) 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。 ①类型II RE一般都很稳定，只需Mg+2作为辅助因子，因此，加0.5Mol/L EDTA络合,可终止反应。 ③ 酶切后末端有3种 ⑤ 同裂酶： ⑦ 同尾酶：识别位点不同， 但切割后产生相同末端 不同的酶需要不同的最适Buffer，主要在离子浓度。为了方便，常采用三种缓冲体系： 　　　　高盐buffer 中盐buffer 低盐buffer 双酶切时，要先低盐buffer，后高盐。 许多公司生产各种RE，也提供最适Buffer和通用buffer。因为不同公司的buffer不同，使用时通常不能通用，因此建议固定购买一家公司的RE。 RE的1单位酶活性是指在最适温度和缓冲体系条件下1h酶切1?g λDNA的活性。具体实验时可作为决定加入酶量的依据. RE通常保存在50%甘油的贮存Buffer中，而甘油在RE反应体系中超过5%时就表现出抑制。故酶切反应时加入酶量不能超过反应体系的1/10。注意双酶切。 酶切时间与DNA纯度和用量，及酶浓度有关。如果DNA样品是结构复杂的基因组DNA,酶切时间可延至18h,而Plasmid DNA的酶切时间较短。长时间切要注意酶切体积的变化。 若电泳分析时嫌酶切产物的体积过大，则可先用乙醇沉淀浓缩DNA，再电泳。 二、连接酶 三、聚合酶（polymerase） 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 1. DNA聚合酶 AMV: 禽源RT, 来源于鸡成髓细胞增多症病毒(Avian Myeloblastosis virus) 1. DNA聚合酶 M-MuLV: 鼠源RT, 来源于鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus) 1. DNA聚合酶 AMV和M-MuLV 具有RNase H酶活性，故合成的cDNA 不是全长的。 1. DNA聚合酶 2. RNA聚合酶 四、其它工具酶 §2 基因克隆载体 基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，注意不能破坏载体的自我复制性质。如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。 基因克隆载体 是存在于天然细菌细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 质粒pUC19的分子结构 可通过转染方式将其DNA送入细菌体内进行增殖。常用的为人工构建的λ噬菌体载体。噬菌体两端的片段对于其包装是必需的，因而应予保留；而其中间部分则可进行改造或置换，使之具有某种单一的限制酶切点。目的基因与噬菌体DNA进行重组时，可采用插入重组方式，也可采用置换重组方式。 哺乳动物常用猴SV40病毒载体，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。 植物已开发出烟草脆裂病毒 (TRV)和大麦条纹花叶病毒(BSMV)的表达载体， （如用于VIGS (Virus-induced gene silencing) ） 基因克隆载体 §3 常用的宿主细菌 §4 原核细胞的转化、筛选与鉴定 选用适当的RE，分别对载体DNA和目的基因进行剪切，以便于重组。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因的重组。 （1）粘性末端连接法： 当载体DNA和目的基因均用同一种限制酶进行切断时，二者即可带有相同的粘性末端。如将载体与目的基因混合在一起，二者即可通过粘性末端进行互补粘合，再加入DNA连接酶，即可封闭其缺口，得到重组体。 载体DNA与目的基因的连接 （2）平端连接法： 用T4 连接酶 加 PEG (聚乙二醇)提高连接效率，但要防止外源DNA片段串联插入 插入的方向随机 效率通常不高 （3）人工接尾法： 即同聚物加尾连接法(同聚尾连接)。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端