3-2基因工程的基本操作程序课件.ppt

如何检测Bt基因是否成功地翻译成Bt毒蛋白？ 将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质； 将表达出的蛋白质注射给动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体； 从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上； 将抗体与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交 蛋白质检测 蛋白质检测： 利用抗原-抗体杂交： 被检测物是蛋白质， “探针”是抗体 目的基因的检测与鉴定 存在与否 分子水平检测 个体水平鉴定 分子杂交技术 抗原-抗体杂交 ：检测性状及产品活性等 表达与否 mRNA 蛋白质 ：DNA 若要培育转基因羊，从羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA。 人tPA基因为什么要和羊泌乳基因重组在一起？ 为什么选择受精卵作为受体细胞？ 怎样将重组tPA基因导入受精卵中？ （07天津卷）下图为获得转基因抗虫棉的技术流程。请据图回答： （1）A过程需要的酶有________________。 （2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是_________________。 （3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入________。 （4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用________________作为探针。 (12年海淀区期中) 大肠杆菌pUC18质粒的LacZ基因中如果没有插入外源基因，lacZ基因便可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTG和X-gal时，X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色，大肠杆菌将形成蓝色菌落。反之，则形成白色菌落。 选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入______物质。成功导入重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成___颜色的菌落，原因 。 * * 构建基因组文库获取目的基因存在的问题： ——费时费事 ——内含子序列 * * * * * * * * * 与Southern Blot或Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 * 北京理工大学附属中学 苏明学 1.2 基因工程的基本操作程序——原理?技术?应用 北京理工大学附属中学 苏明学 重组人胰岛素 （Humulin优泌林） 1982年10月全球第一个商业化基因重组人类胰岛素在美国上市 思考1： 如何利用大肠杆菌来生产重组人胰岛素？ 基因组文库的构建——基因的分离与克隆 思考2：如何从人类基因组中分离胰岛素基因？ 思考3：从基因组文库中获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？ cDNA文库的构建 思考4：能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？ 聚合酶链式反应（PCR） 思考5：如何快速扩增胰岛素基因（cDNA）？ 聚合酶链式反应（PCR） 变性、退火、延伸三步曲 变性：双链DNA解链成为单链DNA 退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链 思考6：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？ 氨基酸序列→mRNA序列→DNA序列→人工合成 DNA合成仪 思考7：选用哪种限制酶对质粒和胰岛素基因进行酶切，可将目的基因插入到Tetr基因内？ 思考8：重组质粒导入大肠杆菌后能表达吗？若不能， 还应做怎样修饰？ 用BamHⅠ对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？ 目的基因 载体 BamHⅠ BamHⅠ DNA连接酶 重组体 载体自连 目的基因 自连 思考9：如何根据标记基因筛选到含重组质粒的大肠杆菌？ 应将体外重组反应混合物转化给 AmpsTets/AmprTetr大肠杆菌菌株？ 将Amp琼脂平板上的菌落原位影印在Tet平板上生长，对比这两个平板上的菌落生长情况，如何挑出含有重组质粒的菌落？ 定向克隆策略——双酶切连接 思考10：如何 避免质粒和目的基因的自身环化？ 大肠杆菌合成的胰岛素具有生物活性吗？ 如何鉴定胰岛素基因在大肠杆菌中是否得到了成功表达？ 酵母菌 若通过基因工程生产干扰素（一种糖蛋白），应选择 (大肠杆菌/酵母菌)作为受体细胞？说明理由