microbial-genetics 3 细菌和放线菌的基因重组和遗传分析课件.ppt

第三章 细菌和放线菌的基因重组和遗传分析 第一节 转化作用（Transformation） Griffith转化研究(1928) 二、转化作用过程 1、感受态出现 感受态诱导 利用高压气体加速，将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入完整的受体细胞中。 二、转化作用过程 1、受体细胞感受态出现 2、转化因子的吸附和渗入 3、转化因子的整合 2、转化因子的吸附和渗入 3、转化因子整合 三、 转化在遗传分析中的应用 2、遗传学图谱的绘制 第二节 接合作用 二、F 因子与接合作用 F因子基因组分三个区段 2、 F 因子存在状态及其它们之间的关系 (二)细菌接合的三种方式 滚环复制的电镜照片 ② Hfr× F- Crosses Mechanism of Hfr x F- Crosses Mechanism of F’ x F- Crosses 三、中断杂交试验及基因定位 1、中断杂交（interrupted mating）技术 2)在杂交过程中，按照特定时间间隔取样，用高速搅拌器将杂交的Hfr和F-分开，涂补于不同选择性培养基上培养。 这种在接合的特定时间内人为的中断杂交以测定重组子基因型的的方法称中断杂交实验。 3）在Hfr×F-的接合过程中，Hfr细胞染色体从F因子的oriT位点开始逐渐向F-细胞转移，靠近oriT位点的基因有更多机会出现在F-细胞中，越是后面的基因转移几率越小。 4）供体菌和受体菌： 供体菌： Hfr：strsthr+leu+azisT1slac+gal+ 受体菌： F- strrthr-leu-azirT1rlac-gal- 将4×108Hfr和2×107 F-对数期细菌混合，培养。 每隔一定时间取样，在组织捣碎机中搅拌以分散接合着的Hfr和F- 细胞 稀释，接种到含链霉素的培养基中，筛选thr+leu+strr重组子，再对每一个重组子的非选择性标记azi、T1、lac、gal进行测定 混合8分钟取样，所得菌落的非选择性标记全部和F- 相同，说明还没有任何Hfr基因进入受体中， 9分钟开始出现azis敏感菌落，说明 azis基因进入F-细胞中 11分钟出现对Ts敏感的F-菌落 18分，出现lac+ 24分，出现gal+ 2.大肠杆菌环形基因图 1）F因子可整合到大肠杆菌不同位置，所以从F+可以得到各种Hfr，它们DNA转移的方向和起点不同 2） wollman和Jacob对分离得到的多株Hfr菌进行杂交中断实验，首次推断大肠杆菌染色体基因组是环形的 3）其遗传图谱须用多株F因子整合在不同位置的Hfr菌才能完成 一 转导作用的发现 LT-2(met-his-) 二 转导噬菌体类型 (一)烈性噬菌体 1 烈性噬菌体 噬菌体遗传学研究中应用得最早而且广泛的是T系列噬菌体 2 一级生长实验和单菌释放实验 一级生长实验：将噬菌体和细菌以1：10混合以保证每一噬菌体都有感染细菌的机会。吸附几分钟后将感染的细菌稀释到抗噬菌体血清中以除去游离的噬菌体，接着又稀释到培养液中进行培养，在培养过程中取样测定噬菌斑数。 从感染到噬菌斑数上升前的一段时间称为潜伏期，从图3.33可以看到T4的潜伏期是24min。 在潜伏期的噬菌斑数就是感染有噬菌体的细菌数 .噬菌斑的最大数值是这些被感染的细菌所释放的全部噬菌体数； 后一数值除以潜伏期噬菌斑数就可以得到每一被感染的细菌所释放的噬菌体的平均数，即释放量 单菌释放实验 混合敏感细菌和噬菌体，吸附5min后立即将菌液稀释到每毫升中只含有2～3个被感染细菌，并立即取少量(例如0.2m1)分装到一系列试管中，使每试管平均只含有0.4-0.6个被感染细菌。 经30min培养后将每一样品混合大量敏感细菌涂在培养基上。 经培养以后可以看到大部分培养皿上没有噬菌斑，少数培养皿上出现个别的噬菌斑，这些是游离噬菌体所形成的噬菌斑； 另外少数培养皿上出现几十甚或1000以上的噬菌斑，大部分是单个细菌所释放的噬菌斑。 噬菌体T1的单菌释放量多数是100～200。 3 基因重组和连锁 噬菌体的基因重组在20世纪40年代中首先在大肠杆菌噬菌体T2中发现。 为了检测噬菌体中的基因重组，首先必须要有突变型。 在噬菌体中最先发现的突变型有快速溶菌(rapidlysis，r)、寄主范围(host range, h)和小形噬菌斑(minute plaque，m)等。 突变型的噬菌斑 r突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑大而且边缘清晰， m突变型的噬菌斑比野生型的噬菌斑较小而边缘模糊， h突变型能在抗野生型噬菌体的细菌上形成噬菌斑。 h突变型和野生型h+可以用混合指示菌方法鉴别 h+只能裂解品系B的野生型大肠杆菌，h能裂解野生型细菌及抗T2细菌(用B/2表示)。 把h和h+噬