PCR与DNA提取一般方法课件.ppt

PCR原理+流程 乌桕DNA提取方法 国内外相关文章 PCR原理 聚合酶链式反应简称PCR（英文全称：Polymerase Chain Reaction） (又称：多聚酶链式反应）， 聚合酶链式反应，其英文Polymerase Chain Reaction(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增。又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 特点 用途 可用于基因分离 克隆和核酸序列分析等基础研究 还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方 (1)扩增各种蛋白的基因： (2)PCR后的测序：可以很快地测出常规的PCR产物或单链的DNA序列 (3)用于分子进化和种系发育的研究，研究其分子进化及种系发育是很有用的 4)分析和诊断遗传性疾病 (5)对人类HLA基因的多肽性分析，对于某些基因突变，如肿瘤发生的研究等均很有用。 主要过程 PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成 模板DNA的变性 模板DNA经加 热至92℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性) 模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸 DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 　　 PCR的反应动力学 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y=(1+X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%， 但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进 入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增物 PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合 时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的 “短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 所需材料 1. 试剂和溶液 (1)10 × PCR缓冲液 500 mM 氯化钾 100 mM Tris-Cl (室温时pH 8.3) 15 mM 氯化镁 (2)10 mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液－含有所有四种dNTPs(pH 8.0) 3)耐热的DNA 聚合酶： ① Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。 ② rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有5’→3’DNA 聚合酶和3’→5’外切酶(校正)的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。 (4)琼脂糖凝胶 (5)10 μM的上游和下游引物 (6)DNA模板 (7)对照DNA(含有靶序列的DNA) (8)DNA长度标准参照物 2. 设