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噬菌体展示技术原理及其应用 主讲人：何文龙 一：噬菌体展示技术的发展过程 1.1985年Smith首次证实丝状噬菌体fd 基因组能通过基因工程的手段进行改造将EcoRI内切酶的部分基因片段(171 bp 和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoRI内切酶抗体所识别. 2.1988年Parm ley etal将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面，可特异性地被抗体选择出来，并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想. 3.1990 年McCafferty et al也报道了用噬菌 体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法，从而开始了这项技术的广泛应用的新时代. 二：噬菌体的基本特征 1.噬菌体属于单链DNA 病毒，包括f1、fd和M13三类.噬菌体DNA在细菌内滚环复制,细菌不被裂解,但生长速度减慢,而且可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒. 噬菌体的单链DNA 长约7000 bp,不同类型噬菌体其一级结构极为相似，基因组编码11 种蛋白质，其中5 种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pⅢ和pⅧ. 2.噬菌体单链DNA被包裹在大约2 700-3 000个主要衣壳蛋白pⅧ分子组成的管状结构中，另外次要衣壳蛋白pⅢ通过与大肠杆菌的F 菌毛结合而引起感染，是噬菌体感染宿主所必需的.pⅧ前体由73个氨基酸残基组成，其中信号肽为23 个氨基酸残基，根据构成外壳的功能可分为四个区，6-24 氨基酸残基区域占据噬菌体表面的大部分，25-35 氨基酸残基区域高度疏水性,C(35-50 氨基酸残基区域)与DNA相结合，构成完整的内壁，N端(1-5氨基酸残基区域)为可活动的、外露在噬菌体表面的肽段，是插入外源基因的最佳位置. 3.pⅢ前体由424个氨基酸残基组成，形成3-5个拷贝，位于噬菌体的尾部，他由四个功能区组成，信号肽区(18 个氨基酸残基)引导pⅢ至细菌胞间质，在pⅢ分泌后被细菌蛋白酶水解，其后的穿膜区与噬菌体的侵入有关，受体结合区负责结合F菌毛，而C端的疏水区组装前黏附在细菌内膜上，组装后这段氨基酸序列锚在噬菌体外壳上，穿膜区是最外露的区域，因而成为插入外源基因的理想位置. 三：噬菌体展示技术的基本原理 1.噬菌体展示技术的定义 噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和选择相结合的技术，他以改构的噬菌体为载体，把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区，使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面，进而通过亲和富集法表达有特异肽或蛋白质的噬菌体. 2.建立这项技术的基本原因 (1)在pⅢ和pⅧ衣壳蛋白的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响和干扰噬菌体的生活周期，同时保持的外源基因天然构象，也能被相应的抗体或受体所识别； (2)利用固定与固相支持物的靶分子，采用适当的淘洗(panning)方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体； (3)外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA 测序推导出来. 该技术实现了基因型和表型的转换. 噬菌体展示技术最关键的优势有三:第一：淘选的高效率使得在极低的存在 水平下,挑选到高亲和力噬菌体成为可能;第二：所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下,通过感染细菌得到富集;第三:展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接,使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便. 3.基因操作 噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质，在基因操作上，他们基本相同. 在信号肽与成熟蛋白质编码区之间有单一的克隆位点便于插入，插入的外源多肽或蛋白质以融合的形式表达出来并分泌到胞间质内，当宿主蛋白酶切除信号肽后，融合蛋白组装成熟，呈现在病毒粒子的表面，新的N端位置正是外源蛋白或多肽的插入点. 与pⅢ基因融合时拷贝数低(不超过5 个)，这可以减少多价结合，利于选择高亲和力的配体分子，可容许插入大的片段. 与pⅧ基因融合时，拷贝数高(2 700 个)，当将属于多肽的表位用作免疫源时可产生良好的免疫应答，具有反应优势，故在疫苗开发上具有潜在的应用价值. 4.亲和筛选的两种方法 （1）直接法 直接法是将蛋白质分子耦联到固相支持物上，文库噬菌体与固相支持物温育，洗去未结合的噬菌体，既获得亲和噬菌体. （2）间接法 间接法是将生物素标记的蛋白质分子与文库噬菌体温育后铺在结合有链亲和素的平皿上，洗去未结合的噬菌体，保留的就是结合状态的噬菌体，再洗脱结合的噬菌体，用这部分噬菌体感染细菌，扩增噬菌体，开始新一轮的筛选，通过几次这样的亲和纯化反应，就能选择性地富集并特异性扩增结合这种蛋白质或DNA