现代分子生物学蛋白质.pptVIP

量子点：因亮度和光稳定性非常高，可反复成像 很难在活体细胞内对量子点标记的胞质蛋白进行观测 免疫靶向的抗生物素蛋白链菌素标记的量子点 （immunotargeted streptavidin-QDs） 荧光标记技术在蛋白质构象改变研究中的应用研究蛋白随时空间改变而发生构象改变时，最常用方法是将某一蛋白质结 构域与2个荧光基团结合，然后对该结构的萤光共振能量转移（FRET） 进行检测 常用荧光基团有CFP、YFP等 FRET 传感器：底物经修饰（橙色，磷酸化修饰）导致构象改变，通过 FRET使发青色荧光的CFP发黄色荧光 FRET效率取决于供体与受体间的距离和方向 FRET反映蛋白分子内部因方向而不是距离改变所造成的构象改变，因为荧 光蛋白分子中有一个发生交替排列或者接头长度发生微小的改变都会 给FRET带来很大的影响，这要比2个荧光蛋白分子间的距离改变对FRET 造成的影响大得多 连接2个荧光蛋白的蛋白质在生化信号的影响下改变构象 如果与定位信号序列融合，这种结构可用于对胞内特定的亚细胞结构研究 荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET） 当一个荧光分子(供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(受体分子) 的 激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。 两个发色基团间能量转换效率与它们间的空间距离的6次方成反比，对空 间位置的改变非常灵敏 例 用CFP作供体、YFP作受体，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激 发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团 上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。 FRET技术原理示意图 荧光标记技术在蛋白与蛋白互作中的应用 FRET用于活体细胞内研究蛋白间互作（图） 三分子FRET作用：蛋白X和Y结合后，使发青色荧光的CFP发黄色荧光， 再与蛋白Z结合发红色荧光 这种方法已用于多蛋白复合体以及三聚体蛋白研究中 BiFC技术可用于研究蛋白表达 BiFC技术具有很高的信噪比，因为它可以形成新的荧光；试验花费时间长 BiFC技术：蛋白X与Y结合导致GFP的2个裂解片段结合在一起，形成生色基团， 发出绿色荧光 双分子荧光互补技术（bimolecular fluorescence complementation，BiFC）： 原理：利用荧光蛋白及其突变体的特性作为报告基因，将荧光蛋白分割成 2个不具有荧光活性的分子片段，分别与目标蛋白连接。若2个目标 蛋白因为互作而靠近，使得荧光蛋白的2个分子片段在空间上相互 靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光。在荧光显微镜下，直 接观察2目标蛋白是否有互作，且在最接近活细胞生理状态下观察 其互作发生的时间、位置、强弱、所形成蛋白质复合体的稳定性， 以及细胞信号分子对其互作的影响等 荧光标记技术在蛋白质合成和降解过程研究中的应用蛋白质降解：分辨“陈旧的”蛋白和“新生的”蛋白 常用方法：用不可逆标记对某一时刻合成的所有蛋白质进行标记，再用另 一种颜色的荧光对迟些时候新生成的蛋白质进行标记 例：1）用高亲和力配体或标记有荧光基团的抗体对内源性蛋白和胞外蛋白 进行标记 2）先用一种双砷（biarsenical）染料标记四半胱氨酸 （Tetracysteine）序列，然后用另一种双砷染料进行标记 FLAsH（bis-arsenical fluoroscein derivative） ： 联砷荧光素衍生物 合成的 细胞可透 FLAsH结合四半胱氨酸:发夹型结合物 FLAsH（绿），ReAsH（红），HoXAsH（蓝），CHoX-As（蓝）等 脉冲追踪技术：Tetracysteine序列标记的蛋白被绿色染料标记后，形成能发出绿 色荧光的FIAsH（绿色小点）；去掉绿色染料后，用红色染料标 记新生的蛋白，形成能发出绿色荧光的ReAsH（红色小点） HaloTag标记 TNF-dependent d