Hela细胞传代培养课件.ppt

Hela细胞传代培养 实验目的：掌握动物细胞培养的基本原理和方法。 实验用具：离心管（2支），移液枪（每个台面一把），枪头（每个台面一盒），吸管（4根），培养皿（每组2个） 实验药品：0.25％胰酶，D－Hanks，1640培养基 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 清洁液的配制 HeLa 是Henrietta Lacks的简称，Henrietta Lacks 是一位患有子宫颈癌的美国妇女的名字，在她死后，该细胞走被广泛散发到各研究机构，并无限次地繁殖分裂下去。 细胞培养的甚本概念 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 培养细胞的特性 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 培养细胞生长的条件 1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃ O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒 CO2培养箱 细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有3种 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l／2一2／3，用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2.悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3.贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。 2 细胞培养用液的配制 D-Hanks原液试剂配方 氯化钠 80.0g 磷酸氢二钠（Na HPO ·2H O） 0.6g 氯化钾 4.0g 磷酸二氢钾 0.6g 三蒸水 1000ml D-Hanks工作液试剂配方 D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml D-Hanks工作液试剂配方 D-Hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml 消化液： 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。