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细胞培养技术（实验篇） 安徽医科大学微生物学教研室 实验四 Hep-2细胞的传代培养 一、原理 体外培养的细胞形成单层汇合以后，由于细胞密度过大,生存空间不足而引起营养枯竭，将影响细胞的继续生长，此时需将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。 传代培养可获得大量的同种细胞，并维持细胞种的延续,同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞倍增3～6次。 二、材料和试剂 1、细胞： Hep-2 细胞 2、试剂： PBS、VTP、DMEM营养液（含10％小牛血清） 3、仪器和器材：倒置显微镜、CO2培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等 三、操作方法 将长成单层的Hep-2细胞弃去原来的培养液，PBS洗2次。 在瓶中加入少许消化液(以液面盖住细胞为宜)，静置3～5分钟。 肉眼观察当见到瓶底出现细针孔空隙时终止消化。倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞相互之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。这时应立即将消化液倒掉，加入适量新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。 以1：2或1：3进行分装，标记，置37℃培养。 四、结果 置于37℃培养的细胞，次日开始需逐日进行观察，主要观察： （1）培养物是否被污染 （2）细胞生长状况 （3）如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征 五、注意事项 严格的无菌操作 适度消化 每天观察细胞形态，生长致密时即可传代。 如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施。 谢 谢！ * * 2007年12月3日 合肥 Hep-2细胞 ×100
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