现代色谱分离技术(中国海洋大学)课件.ppt

现代色谱分离技术 主要内容 引 言 薄层色谱(Thin Layer Chromato-graphy)，又称薄层层析，常用TLC表示。 将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分离的物质展开。 薄层板 固定相：硅胶为使用最广泛的薄层材料。 除此之外还有氧化铝、硅藻土等。 常用薄层硅胶的特征： 薄层板的制备方法 薄层色谱分类 （一）定性薄层色谱 1 点样 样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。 点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。 点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。 点样位置：距底边约1-2cm的起始线上，点与点的距离为0.5-1cm。 点样方式：定性分析-点状点样。 （直径3-5mm的圆点） 制备薄层-条状点样。 2 展开 2 展开 展开后将溶剂吹干。 常见的定位方法： (二)制备薄层色谱（PTLC） 特点： 1 较分析薄层样品液的浓度大。 2 板较大，较厚（吸附剂用量多） 3 点样多点成直线。 样品的检测 有色物质直接观察斑点。 荧光物质紫外灯下观察。 如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。 样品的收集 切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。 回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常用。 TLC的特点 方法简便易行,价格低廉； 分析快速； 检出灵敏度高； 分离能力强； 检测手段多样化； 应用广泛； 柱色谱 (一)硅胶柱色谱 1 原理： 根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组分以不同的速率向下移动，吸附弱的组分随着流动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物的分离。 3 操作步骤 （二）凝胶柱层析 1 原理 2 凝胶层析中常用的凝胶 3 凝胶柱的使用 （三）大孔树脂柱色谱 1 原理： 大孔树脂为新型非离子型分子聚合物吸附剂，白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在孔穴的微观小球组成，称之为“大孔”。 2 特点 理化性质稳定。 分离性质优良。 溶剂用量小。 可重复使用。 对天然产物化学成分如皂苷、生物碱、黄酮及其他一些苷类成分都有一定的吸附作用，对色素吸附作用较强。 3 操作步骤 (四) ODS反相柱层析 1填料: ODS(octadecyl bonded silica) ,十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质键合的C18填料, ODS适用于分离中等偏大的化合物。 与HPLC不同，开放式ODS是将ODS装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵加压。 2 操作步骤 引 言 以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，流动相改为高压输送，采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分离分析方法。该法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等特点，因而称为高效液相色谱法。 （一） HPLC工作原理 液相色谱柱分类 正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶表面键合-CN,-NH2等官能团。 反相柱：以硅胶为基质，在其表面键合碳十八（ODS） 、碳八、碳四等官能团的非极性填料。 （二） HPLC分类 （三） HPLC的使用 溶 胀 装 柱 上 样 洗 脱 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）为干粉，装柱前量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重， 称重后足量用有机溶剂（常用氯仿：甲醇=1：1）溶胀。 将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关闭下口，使凝胶完全沉降。 湿法上样： 打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液，使液面与凝胶表面相平齐。 将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（3—5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。 控制流速，过快或过慢影响分离效果。 流出液分步收集，分析、合并。 大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用其对