园艺植物原生质体融合技术研究进展..doc

1 引言 原生质体融合（protoplast fusion）亦称细胞融合（cell fusion）、体细胞杂交（somatic hybridization）、超性杂交（Para sexual hybridization）或超性融合（Para sexual fusion ），是指不同种类的原生质体不经过有性阶段，在一定条件下融合创造杂种的过程[1]。植物细胞融合技术包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。原生质体融合涉及了双亲的细胞质，它不仅可以把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组或线粒体基因组间重新组合。原生质体融合还可避免受精作用中的种的特异性配子识别反应，有可能打破远亲杂交中的有性不亲和界限。原生质体技术还可用于种质资源的保存、细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入等方面。 原生质体融合技术起源于20世纪60年代，是基因重组技术的一部分。经过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞，并得以表达，以期使得受体细胞在原有性状的基础上，获得所需的新的特殊性状[2]。1953年we bull首先用肤聚糖水解酶，溶菌酶得到巨大芽胞杆菌的原生质体，1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nagata等首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株，1972年Carlson等以烟草获得了体细胞杂种[4] ，1974年高国楠发现聚乙二醇（PEG）在钙离子存在的条件下能促使植物细胞原生质体融合，1975年Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体,经培养通过胚状体再生出植株，1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株 并从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。近年来原生质体融合技术进展十分迅速，利用原生质体直接进行遗传转化的发展也引起了普遍的关注，为工农业生产实践开辟了广阔的发展前景。 2 原生质体融合方法 早期原生质体融合方法有：硝酸钠法、高Ca+高pH法、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、PEG与高Ca+ 高pH相结合法、电融合法以及聚集微束激光法。目前，国内外实验室广泛使用的是化学法中的PEG一高Ca+ 高pH 法和物理法中的电融合法。 2.1电融合法 20 世纪80 年代初开始探索使用电融合法，1979年Senda建立的电融合法是目前最流行的物理诱导融合方法[5]。其原理是利用原生质体在交变电场作用下相互接触并排列成串后，施加一次或几次高压直流电脉冲，使相互接触的原生质体质膜发生局部可逆击穿，形成融合体。该方法避免了化学药剂的毒害作用，操作简便，快速，融合同步性好，可在显微镜下观察融合的全过程，整个过程中的参数容易控制细胞电融合。近年来，已经测出数十种植物原生质体的电融合参数，并获得部分细胞杂种。这是近年来融合技术上取得的最突出的成就，有可能解决融合细胞的选择问题[6]。利用电融合法获得了菊花与智利喇叭花(茄科)的科间杂种 (D．×grandiflorum×Salpiglossis sinuateu)、菊花与大籽蒿的属间杂种(D．×grandiflorum×Artemisia sieversiana )、莴苣属内种间杂种(L．sativa×L．virosa 、L．sativa×L．perennis、L．sativa×L．tat Arica ) Sherraf等[20]用电融合法诱导野生型番茄和耐盐系双单倍体土豆融合，得到再生植株，并得到介于双亲中间型的叶片和地下果实，杂种的耐盐性降低了50%。Brewer等[21]用电融合法诱导了植株矮小但可富积重金属锌和镉的Thlaspicaerulescens和植株较高大的Brassica nap us融合，并得到在含高锌和镉的土壤中存活的再生植株，使通过体细胞杂交将高积累重金属品系的基因转移到其它植物中成为可能。 2.2 PEG一高Ca+ 高pH 法 1974年Kao 建立了聚乙二醇(PEG)法，经过不断改进建立起来的PEG一高Ca+ 高pH 法，至今应用广泛。原生质体融合的报道多采用了该方法。但融合频率不高仍是这项技术的弱点。Kiriti等报道的融合频率为5%，Chen等报道的融合频率约4.5% 。细胞融合要求新鲜的原生质体，Zhao等发现，在2-4 h内已有部分细胞生出了新的细胞壁。近年来一些研究者发现，加入二甲基亚砜(DMSO)可以有效地提高融合频率[7]。孙蒙祥等报道，用PEG诱导选定的成对原生质体