6种中药提取物对胃癌细胞株细胞毒作用及多西紫杉醇增敏作用的研究_禹立霞.docx

中药提取物对癌细胞作用及多多西紫杉醇增敏作用胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，对于进展期胃癌，药物治疗是目前临床主要手段，但其有效率均小于50%。因而开发新型低毒高效抗癌药物及开展基因指导下的个体化用药是当今胃癌药物治疗的主要方向。本文中，我们研究了6种中药提取物的具有细胞毒作用活性成分在低细胞毒计量时对于胃癌细胞DOC敏感性的影响：一、6种中药提取物对胃癌细胞作用实验的材料与方法（一）药物与细胞株 　连翘与独活饮片；汉防己甲素；藤黄酸；白藜芦醇；胃癌细胞DOC (纯度 99%)；人低分化胃癌细胞BGC-823和人中分化胃癌细胞株 SGC-7901。 （二）提取方法 　①连翘有效组分分离：连翘果实粉碎呈粉末状，8倍量95%乙醇浸提取3次，乙醇提取物挥干得浸膏采用水和石油醚 、乙酸乙酯分歩萃取的方法，获得连翘乙酸乙酯提取物，干燥后上硅胶柱经石油醚、乙酸乙酯混合溶液 (分别为 8∶1和 10∶1)分次洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发仪旋干得2个组分，经鉴定分别含安博立酸(纯度鉴定，质量分数达90%以上)及达玛烷型三萜类化合物(纯度达 60%以上)，因而命名为AA与DA。②蛇床子素提取方法：独活饮片于60℃恒温干燥4h，粉碎过20目筛。10倍量95%工业乙醇回流提取3次，减压回收乙醇，得粗提物，真空干燥得总浸膏。以石油醚萃取，减压回收溶剂并干燥，将石油醚部位用硅胶柱色谱分离，石油醚 -乙酸乙酯梯度洗脱，在10∶1洗脱部位得一粗膏状物，石油醚、乙酸乙酯反复重结晶，得无色方形结晶，经鉴定为甲氧基欧芹 素 (纯度 95%), 命名为SC。（三）细胞毒实验 　指数生长期细胞以4000 /孔种入96孔板，过夜贴壁后，加入含药培养基。细胞继续培养72h后，加入20μlMTT(5mg/ml)。继续孵育4h，弃上清，每孔加入200μlDMSO溶解。全自动酶标仪读取数据。IC50计算采用中效原理计算。其中，药物作用效应即抑制率 (Fa)：两边取对数Log(Fa/Fu)=mlogD-mlogDm设a=-mlogDm，b=m，x=logD，y=log(Fa/Fu)，代入中效方程式：y=bx-a，其中，Fa为药物作用效应，Fu=1 -Fa;D为药物浓度，m为斜率；Dm为中效浓度，即效应为0.5时所对应的药物浓度。（四）CI指数法判断药物间相互作用 　根据 Chou-Talalay中效原理进行 CI(Combinedindex)指数的计算。 CI定义为 :其中，D1、D2为 2种药物合用时产生x效应时2种药各自所需浓度，Dx1、Dx2为2种药单独使用时产生x效应时2种药物各自浓度。α=0为2种相互排斥性药物(作用途径相似)，α=1为2种相互非排斥性药物 (完全不同的作用途径)。 CI1表示 2种药物有协同作用；CI=1表示相加作用；CI1表示2种药物有拮抗作用。（五）统计学分析 　用SPSS15.0软件进行统计学处理，计量资料用均数±标准差 (x±s)表示。采用t检验比较组间差异，以P≤0.05为差异有显著性统计学意义，各实验均重复3次。二、6种中药提取物对胃癌细胞作用实验结果（一）6种中药提取物对胃癌细胞株增殖抑制作用为比较 6种中药提取物细胞毒作用，将6种提取物浓度均设为100、10、1、0.1、0.01μmol/L，作用48h后测定细胞存活率。结果见图1：6种中药提取物对于2株胃癌细胞均具有一定的细胞毒作用。其中，藤黄酸细胞增殖抑制作用最强(IC50 SGC-7901 2.55μmol/L;BGC-823 0.77μmol/L)，其次是汉防己甲素(IC50 SGC-7901 4.11 μmol/LBGC-823 3.67μmol/L)。其余4种中药提取物体外细胞增殖抑制作用相对较弱，其中高剂量连翘达玛烷组分、白藜芦醇和蛇床子素均未达到 50%抑制作用。（二）低细胞毒作用剂量中药提取物对于 DOC增敏作用 　 取中药提取物对于肿瘤细胞抑制率为20%左右剂量，剂量见表1：将相应剂量中药提取物与 DOC同时作用于胃癌细胞48h，各剂量下抑制率见图2：在SGC-7901细胞株，低剂量DA能够显著提高DOC对于细胞的抑制作用，其余各中药提取物均未见明显作用。在BGC-823细胞，DA与SC均能提高DOC对于细胞的增殖抑制作用 (P0.05)。由此，我们选择 DA进一步研究。（三）连翘达玛烷组分在胃癌细胞对于 DOC具有协同作用 　由于药物对肿瘤细胞抑制率偏低，因此在后续实验中均采用72 h作为观察终点。DA与DOC对于胃癌细胞SGC-7901与BGC-823的IC50见表2：2种药物合用后 , 细胞存活率明显下降(图3)：采用CI指数法对于结果进行判断。SGC-7901细胞中等抑制作用(Fa约在0.4～0.8之间)时， CI1， 2种药物具有协同作用；BGC-823细胞