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人外周血内皮组细胞的培养与鉴定 付强，郑昭芬?，彭建强，何晋，王照飞 （湖南师范大学第一附属医院 湖南省人民医院 心内科 湖南省长沙市410005） 摘要：从外周血中分离单个核细胞（MNCs），种植在纤维连接蛋白（Fn）包被的六孔板，以EGM-2培养基定向诱导培养。培养第4天，全量换液后可见梭形或多角形贴壁细胞，镜下可见多个呈“血岛”样生长的细胞集落，集落中间为聚集成簇的圆形细胞，周边环绕放射状梭形细胞。培养初始2周，梭形细胞首尾相连呈条索样生长或两排细胞平行排列呈管样生长，并可见条索样或管样排列的细胞相互交错成网。培养至第3周，细胞呈现为铺路石样外观；经传代后具有次级集落形成能力。流式细胞术显示内皮组细胞（EPCs）表面标志物CD34，KDR呈阳性，而单核、巨噬细胞系表面标志物CD14无表达。激光共聚焦显微镜下，EPCs具有摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的能力。 关键词：单个核细胞；内皮祖细胞；细胞形态学；细胞表型 1. 材料与方法 1.1 材料 淋巴细胞分离液购自天津灏洋，磷酸缓冲盐溶液(PBS)、胎牛血清（FBS）、青链霉素购自Hyclone，EGM-2购自Lonza，胰蛋白酶购自Amresco，人纤维连接蛋白（HFN）购自merck，DiI-acLDL购自Molecular probes，FITC-UEA-I、Galetin购自Sigma，PerCP/Cy5.5-KDR、PerCP/Cy5.5-IgG购自BioLegend，PE-CD34、PE-IgG、FITC-CD34、FITC-IgG购自Beckerman。外周学取自本课题组志愿者。 1.2 方法 1.2.1 密度梯度离心法分离人外周血MNCs及其诱导培养 采集人外周血25ml至含枸橼酸钠的50ml离心管，然后将抗凝血用PBS等倍稀释；将稀释后的抗凝血与人淋巴细胞分离液按1：1的比例沿离心管壁缓慢置于淋巴细胞分离液上，4℃、400g离心30 min；离心后分为4层：上层为血浆、血小板和PBS，中层为淋巴细胞分离液，底层为红细胞和粒细胞，中层与上 ? 通讯作者。E-mail: xyxnzzf@126.com 长沙市民生科技支撑资金专项 K1106022-31 层交界呈混浊的白膜层为MNCs层；用移液枪吸取MNCs层收集于新的50ml离心管中，用适量PBS洗涤两遍；洗涤条件为：4℃、250 g离心10min。 接种前预先将6孔板用50ug/ml Fn包被24小时（5μg/cm2 ）,接种时吸弃Fn，用PBS洗涤2次；用EGM-2诱导培养液(含 10%FBS和100U/ml青链霉素)重悬MNCs；用EGM-2诱导培养液调整其浓度至5×106个/mL，接种至6孔板中，每孔加2mL，置于37℃，5%CO2，湿度大于95%下培养；4天后首次更换培养液继续培养，以后根据营养状况每周换液2-3次，相差显微镜下观察内皮祖细胞的形态特征。 待细胞融合约80%时，弃尽旧培养液，用2mlPBS洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 200μL消化约1min，倒置显微镜下观察，若细胞胞质回缩、细胞间隙增宽、细胞变圆，立即用EGM-2培养液2mL终止消化，轻柔吹打混匀细胞；吸取细胞悬液置入15mL离心管中，用PBS稀释至15mL，4℃下100g离心5min，洗涤后加入EGM-2培养液重悬细胞；细胞计数后以1×104/cm2的接种密度进行传代，根据营养状况每周换液2-3次。 1.2.2 人外周血EPCs的鉴定 EPCs表型流式细胞术鉴定：第二代细胞培养至约80%融合时消化至加入1ml PBS的EP管中，250g离心5min 洗涤细胞；用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为1.0×107/ml，取1OO ul细胞混悬液置于编号（A,a-C,c）的EP管中；A-C管中分别加入下述直标抗体10 ul：鼠抗人PE-CD34、鼠抗人PerCP/Cy5.5-KDR、鼠抗人FITC-CD14，同型对照a-c管中加入等量各自荧光标记的鼠IgG，室温避光孵育1h；孵育完毕后各管加入PBS 500u1，250g，离心5min，用500u1 PBS重悬、混匀后，Accuri C6流式细胞仪检测。 EPCs摄取Dil-acLDL和结合FITC-UEA-1的功能鉴定：细胞接种前将圆形盖玻片浸于含200μl Galetin的24孔板中，孵育过夜；次日吸弃Galetin，消化第二代细胞，传代接种至24孔板中盖玻片上，根据营养状况及时更换培养基；待细胞融合约50%时吸弃培养基，PBS漂洗3次，避光加入含Di1- ac-LDL(10 ug/mL)的培养液200 ul，置于37℃, 5%C02, 95%湿度下孵育4小时；孵育完毕吸弃培养液，PBS漂洗3次，加入4%多聚甲醛固定3