人肝糖原酶联免疫分析.docVIP

人肝糖原酶联免疫分析 　　试剂盒使用说明书 　　本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆，细胞上清及相关液体样本中肝糖原的含量。 　　实验原理： 　　本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肝糖原水平。用纯化的人肝糖原抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肝糖原，再与HRP标记的肝糖原抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肝糖原呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人肝糖原浓度。 　　试剂盒组成： 　　试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 　　说明书1份1份 　　封板膜2片(48)2片(96) 　　密封袋1个1个 　　酶标包被板1×481×962-8℃保存 　　标准品：270ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存 　　标准品稀释液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存 　　酶标试剂3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存 　　样品稀释液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存 　　显色剂A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存 　　显色剂B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存 　　终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存 　　浓缩洗涤液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存 　　样本处理及要求： 　　1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 　　2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 　　3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 　　4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 　　5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 　　6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融. 　　7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。 　　操作步骤： 　　1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀;混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为180 ng/L，120ng/L ，60 ng/L，30ng/L，15ng/L)。 　　2. 加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 　　4. 配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。 　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 　　7. 温育：操作同3。 　　8. 洗涤