实验三 氨基酸的分离鉴定课件.pptVIP

实验三 氨基酸的分离鉴定 ——纸层析法 一 、实验原理 用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。 滤纸纤维的－OH 基的亲水性基团，可吸附有机溶剂中的水作为固定相，有机溶剂作为流动相，它沿滤纸自下向上移动，称为上行层析；反之，使有机溶剂自上而下移动，称为下行层析。将样品点在滤纸上进行展层，样品中的各种氨基酸即在二相中不断进行分配，由于它们各自的分配系数不同，故在流动相中移动速率不等，从而使不同的氨基酸得到分离和提纯。 层析法的定义 层析法是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。 几种常用的层析法 ㈠ 吸附层析 使一种表面具有吸附分子的特征的固体（特别使当它是多孔的和分得很细的时候）。 ㈡ 离子交换层析 利用含有能与周围介质进行离子交换的不稳定的不溶性基质来分离物质。 ㈢ 分配层析 常用吸附层析分离法易溶于有机溶剂而难溶于水的混合物。可电离的水溶性混合物最适宜用离子交换层析法分离。分配层析法界于两者之间。 ㈣薄层层析 是将支持物在玻璃板上均匀地铺成薄层，把待分析的混合物加到薄层上，然后选择合适的溶剂进行展开，而达到分离鉴定的目的。 ㈤凝胶层析 是用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定（凝胶），从而使物质分离。 ㈥亲和层析 使分离蛋白质酶等生物大分子的一种极为有效的方法。 纸层析法主要是依据混合组分对二相分配系数的差异进行分离，但亦存在着某种程度的吸附作用和离子交换现象。 氨基酸在滤纸上的移动速率用Rf 表示： Rf = 原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离 二、 实验步骤 1. 裁剪层析滤纸：长＝17cm,宽＝14cm; 在纸的一端距离边缘2cm处画一条直线，在直线上每隔2cm做一个标记X。 2. 点样： 用玻璃毛细管快速蘸取氨基酸溶液，接着在“X”中心点准确快速点样，然后马上缩回，要求点在纸上的扩散直径不超过5mm； 氨基酸的点样顺序为：赖氨酸－脯氨酸－缬氨酸－苯丙氨酸－亮氨酸－混合氨基酸； 最后用胶布将滤纸粘成筒状，注意边缘不要接触。 3. 扩展： 将扩展剂倒入层析缸中，再快速把滤纸直立于层析缸中，盖上盖子；扩展剂自动会向上扩展，当扩展剂快接近溶剂前沿线时，取出滤纸，然后用铅笔将溶剂前沿痕迹描绘出来（以便计算Rf），最后再用吹风机吹干。 4. 显色： 用滴管取茚三酮正丁醇溶液，滴在溶剂前沿痕迹线下部的滤纸上，使其与氨基酸反应后显色；然后再用吹风机将其吹干，即可显示出各种不同颜色的层析斑点。 5.计算各氨基酸的Rf值。 The end * *