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原位杂交演示实验讲义一、组织标本以及器皿的处理1. 实验动物心脏灌流，一方面是除去血液中物质的干扰，另一方面可以更好的保持组织形态。2. 玻璃器皿常规洗净后 应用RNA酶抑制剂，如0.1%的DEPC水溶液，浸泡处理若干小时，然后高压灭菌除去DEPC，最后180℃烘烤4h。3. 载玻片预处理：常规处理步骤后，180℃烘烤4h，然后APES粘片。4. 冰冻切片制备。二、RNA探针制备流程1.总RNA的提取以及反转录制备cDNA：（1） 将台式离心机置于4度冰箱预冷；（2） 匀浆器头使用前后须作如下处理：a. 3％ H2O2浸泡15-30min；b. 灭菌水冲洗2次，甩净，晾干；c. 匀浆；d. 匀浆后用浓度不高于0.5％的SDS洗液清洗，再用灭菌水冲洗至无白沫；e. 无水乙醇浸泡，干燥，防止生锈；（3） 取1ml TIRZOL加入小试管中，同时加入组织块100mg。若组织块大于100mg，使两者比例保持为1ml ：100mg；（4） 匀浆。匀浆时应将匀浆器转速调到最大，每次转10秒钟，转多次，以防止匀浆器及其内液体过热，导致RNA降解；（5） EP管中匀浆液在室温下放置5min，4度12000×g离心10min；（6） 按每1ml TRIZOL液加入0.2ml氯仿，用力振荡15s，混匀后室温放置2-3min，4度12000×g离心15min；（7） 将上清液移入另一DEPC处理过的EP管中，按每1ml TRIZOL液0.5ml异丙醇的比例加异丙醇，混匀，室温放置10min；（8） 4度12000×g离心10min后，去净上清；（9） 75％乙醇洗涤沉淀，4度7500×g离心5min，然后去掉乙醇；（10） 加适量（40ul） DEPC水或去离子甲酰胺溶RNA，用分光度计测OD260值，计算RNA含量。 RNA含量（ug/ul）＝OD260×40×稀释倍数/1000。（11）根据TaKaRa BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1试剂盒方法反应体系2×Buffer 10ul25mM MgSO4 4uldNTP Mixture 1ulRnase In 0.5ulBcaBEST Polymerase 1ulOligo dT Primer 1ul（或Random Primer 1ul）（或特异的下游引物 1ul）实验样品（总RNA不大于1ug） 1ulRnase Free dH2O 1.5ul反应条件：65度×1min - 30度×5min -15min～30min内匀速升温到65度- 65度×15min - 98度×5min - 5度×5min2. PCR及其产物的回收：使用设计的特异引物，以总cDNA为模板进行PCR扩增。 100ul反应体系蒸馏水 66ul（66％）10×Buffer 10ul（10％）dNTP 8ul（8％）酶 1ul（1％）引物-1 5ul（5%）引物-2 5ul（5％）模板 5ul（5％）大量扩增、电泳后，按小量胶回收试剂盒说明进行胶回收。3. PCR产物与载体的连接：根据Promega pGEM－T Vector System试剂盒方法体系 10μL2×Buffer 5μLT-Vector 1μLDNA 25ng/1μLH2O 2μL连接酶 1μL 25℃ 1-2h4. 转化重组质粒以及重组质粒的初步鉴定：（1） 将感受态细胞从-80℃冰箱取出，迅速解冻放于冰水中，加入已连接质粒，轻混匀，冰上放置30min；（2） 42℃水浴90s；（3） 快速移入冰水中，放置30min；（4） 加4倍菌液体积的LB液体培养基，混匀，封口,37℃振荡培养30-60min；（5） 取300μL用涂布棒均匀涂于Amp+平板上，待平板菌液干后，用封口膜封好，37℃倒置过夜培养14-16h；（6） 挑单菌落于10ml AMP+LB液体培养基，37℃ 200r/min培养5-8h；（7） 菌液测序：检测插入片段有无突变以及判断插入片段的方向；（8）