蛋白质含量和核酸含量的测定课件.pptVIP

蛋白质含量的测定方法 一、双缩脲法 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物其最大光吸收在540nm处。 蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于1~10mg /mL。 双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。 仪器： 试管及试管架、吸量管、分光光度计、分析天平、震荡机、刻度吸管、100ml具塞三角瓶、漏斗 试剂： 双缩脲试剂 1.??标准蛋白溶液 两种浓度的结晶牛血清白蛋白溶液(BSA)。 ?2. 待测蛋白质溶液 人血清（稀释适当倍数，使其浓度在标准曲线测试范围内。 0.05mol/L的NaOH溶液 二、凯氏定氮法 原理：凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质的含量, 此法的结果称为粗蛋白质含量Π 由于样品中含有少量非 蛋白质含氮化合物，如核酸、生物碱、含氮类脂、以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物; 凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确、操作较为简单的方法之一, 可用于所有动、食品的分析及各种加工食品的分析, 可同时测定多个样品,故国内外应用较为普遍, 是个经典分析方法. 此法可应用于各类食品中蛋白含量测定。凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改进后的改良凯氏定氮法。目前通常以硫酸铜作催化剂的常量、半微量、微量凯氏定氮法样品质量及试剂用量较少, 且有一套微量凯氏定氮器。在凯氏法改良中主要的问题是, 氮化合物中氮的完全氨化问题及缩短时间、简化操作的问题, 即分解试样 所用的催化剂。常量改良定氮法在催化剂中增加了二氧化钦 仪器： 凯氏烧瓶500ml、 可调式电炉、蒸汽蒸馏装置、 铰肉机Π 蓖孔径不超过4nm、 组 织捣碎机、 粉碎机、 研钵Π 玻璃或瓷质、 化学消化器、 凯氏定氮仪、 空气滤过器。 试剂： 三、紫外吸收法 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。 此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。 此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。 仪器： 紫外分光光度计、吸量管、试管和试管架、移液枪 试剂： 1mg/ml的牛蒡血清白蛋 白溶液、 浓度为1mg/ml左右的蛋白溶液、 四、酚试剂法 原理：Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。通过比色测定，参照已知含量的标准蛋白质的标准曲线，可确定待测样品的蛋白质含量。本法可测定蛋白质含量的范围在25～250μg/mL。由于不同蛋白质所含酪氨酸和色氨酸残基的量不同，致使等量的不同蛋白质所显示的颜色深度不尽一致，产生误差。如果所用溶液或样品中含有带“-CO-NH2”、“-CH2-NH2” 、“-CS-NH2”基团的化合物，或者溶液或样品中含有氨基酸、Tris、核酸、蔗糖、硫酸铵、巯基及酚类等化合物时，会给本方法的测定带来干扰。磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin-酚试剂B）仅在酸性条件下稳定，而蛋白质的显色反应需在pH10的环境中进行，因此当试剂B加入后应当立即充分混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前与蛋白质发生显色反应，这对于结果的重现性非常重要。 仪器： v