- 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
- 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
流式细胞凋亡检测Qamp;A
关键词: 流式 细胞 凋亡 检测 2013-02-21 00:00 来源:丁香园 点击次数:1222
1. Q:要做胃粘膜组织的DNA含量及倍体检查,但取材后要等几个星期才会做流式细胞术检查,请问:胃组织要怎样保存好呢?用低温保存,还是用乙醇固定?或者固定后再低温下保存?
A:我做过乳腺细胞的DNA含量测定,取得组织以后,先处理成单细胞悬液,然后再加70%冰乙醇固定,要保证冰乙醇的最终浓度为50%,这样固定的细胞悬液可以至少保存12小时,最多可保存一个月,上机检测前再加PI综合染液。我就是这样做的,保存了将近三个星期,结果还可以,变异系数为5%.
2. 实验中想用PI分析细胞周期及凋亡率,请教几个问题:
Q:(1)所用的RNAs酶用什么配制呢?用PBS配吗?
A:RNaseA用PBS配制没有问题,但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q:(2)测细胞周期和凋亡率时都要用RNAs酶,可以一起检测吗?
A:用流式细胞仪测定时细胞周期和凋亡率是同时测定的,不用担心。
Q:(3)TritonX-100是固定剂吧,用了70%的冷乙醇(是4吗?),是不是就不用Triton X-100固定了?
A:Triton X-100是起透化作用的,不是固定剂,可以用75%的乙醇于-20度固定。
Q:(4)还要设什么内参标准(5%鸡红细胞)吗?
A:对照肯定是需要的,这个根据自己的需要进行设置。
Q:(5)不用试剂盒行不行啊?
A:完全可以不用试剂盒。
以下提供一个自己的实验步骤供参考:
(1)200×g离心10 min 收集细胞;
(2)弃去上清,PBS漂洗一次,将细胞重悬于预冷的80%乙醇中,-20°C固定24 h以上;
(3)进行流式细胞仪检测前,200×g离心10 min 收集固定后的细胞;
(4)PBS洗涤一次,200×g离心10 min 收集细胞;
(5)将细胞重悬于含100 ug/ml RNase A和50 ug/ml PI的PBS中,室温孵育30 min;
(6)将经PI染色和RNase A消化后的细胞悬液用300目的尼龙膜过滤后即可利用流式细胞仪进行细胞周期分布和凋亡细胞定量的分析。
3. Q:流式检测细胞周期时加RNA酶所需的温度?
A:其实有关RNA酶在凋亡检测制样过程中使用的必要性问题尚有人持不同意见,该观点的人认为RNA酶在环境中无所不在,常规制样过程中所接触的试剂和环境中的RNA酶已足以降解样品中的RNA,所以为了简便实验操作,也有人不加RNA酶或如你所参考的方法将其与PI染液一起使用。不过经典的方法还是“先加RNA酶37度孵育30 min,然后加PI 4度孵育30 min”。
至于染色时使用4度,是因为低温可减弱分子运动,增强荧光染料结合的稳定性和减少可能的荧光损耗。上流式前细胞用75%乙醇固定行吗?
4. Q:我养肿瘤细胞,测周期。看到帖子说70%乙醇必须用PBS和乙醇配,用水配细胞会碎裂,有帖子说PBS和乙醇配会出现絮状物。上流式前细胞用75%乙醇固定,就用买来的现成的瓶装75%乙醇,行吗?必须那么严格吗?
A:先用冷PBS悬浮细胞,大约1~2 ml,充分悬浮,使细胞充分分散成单细胞。之后缓慢加入无水乙醇,终浓度为70~75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是:直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象,很难重悬成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。
5. Q:我要做流式分析细胞周期,我大概收集了106细胞,但细胞在乙醇固定之后,还看到有细胞沉淀的,但PBS洗涤两次之后,就基本没什么细胞沉淀了,上机发现就发现不了细胞了。这是怎么回事啊?怎么解决这个问题啊?
A:很可能是洗细胞的过程中丢失了,解决办法有:
(1)尽量采用尖底的离心管和水平离心机
(2)离心后尽量用吸管吸取上清,不要倾倒;吸上清时最好残留1 mm 左右的水膜,不要吸完。
(3)离心的转速或时间可稍微增加一点儿
(4)每次加抗体时,吸头最好不要接触液面;混匀时最好不要用吸头吹打,以免吸头挂壁带走部分细胞。
6. Q:流式细胞PI单染中为什么用RNAse?
A:在测细胞周期时,因为已经在细胞膜打孔了,PI很容易透过细胞膜和DNA结合,但RNA也是核酸,也会被染色,为避免干扰染色前需用RNAse降解RNA。这样PI只染DNA,能精确以荧光强度反映DNA的含量。
7. 最近做了几次流式细胞仪检测细胞周期,发现有几个问题:
Q:(1)我所用的是肿瘤细胞, 但是同样的细胞类型,同样的处理因素,虽然两次独立实验作出来的结果总体趋势都是在某种药物干预后,S期比例下降,但两次结果S期比列具体数值相差很大,同样,G2/M期在干预前后无变化,但两次独立实验数值却相差很大,那么可以说,做流式是每次细胞状态不一样,结果也会相差
您可能关注的文档
最近下载
- 施工组织设计报审表施工组织设计报审表.doc VIP
- 2024-2025学年高二物理专项复习:波的干涉【五大题型】(解析版).pdf VIP
- CYX-QEHP-06人力资源控制程序E0.doc VIP
- 化学品船的洗舱和验舱指南 .pdf VIP
- 胰十二指肠切除术后胃瘫的诊治策略.pptx VIP
- 四川成都市简州新城投资集团招聘笔试题库2023.pdf VIP
- 民航管制运行风险主题探索.docx VIP
- HGT20510—2014仪表供气设计规范.pdf VIP
- 网课实验室安全与管理答案(潍坊医学院).docx VIP
- 2024年风景园林专业中级职称《法律法规及技术标准》考试题库(含答案).docx VIP
文档评论(0)