人体寄生虫学实验补充教材.docVIP

人体寄生虫学实验补充教材 前 言 人体寄生虫学是临床医学、基础医学、法医学、预防医学等专业的必修课程，也是一门实践性很强的学科。实验教学的内容包括了形态和功能两大部分，教材采用本室自编的《人体寄生虫学实验指南》，该教材已沿用多年，虽几经修订，但其中涉及功能的综合性实验内容较少，已不能满足基础医学专业本科生实验教学的需要。 本教材是在现有实验教学的基础上，将多年来在基础医学专业本科生中开展的人体寄生虫学的综合性功能实验进行整理汇编而成，以人体寄生虫病为主线，运用免疫学、分子生物学等研究方法，通过一个个相对独立的实验，探讨有关人体寄生虫病的诊断、致病机理等方面内容，为学生将来从事医学研究工作奠定基础。 本补充教材主要供本校基础医学专业学生使用，也可作为临床医学八年制学生的实验参考资料。 病原生物学系 2005年12月 第一部分 日本血吸虫致病相关实验 实验目的：掌握日本血吸虫的主要感染方式、寄生部位及成虫形态特征；掌握日本血吸虫病的诊断方法；了解肝、肠组织内日本血吸虫卵的形态及其病变特征，日本血吸虫的虫卵抗原和成虫抗原的制备。 实验一 日本血吸虫动物模型的建立和解剖 （本实验为自主设计实验，具体要求和内容见《人体寄生虫学实验指南》） 实验二 诊断日本血吸虫病的免疫学方法之一——ELISA 实验原理： 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）PBS (10 mM pH7.4) NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 .12H2O 2.9g KH2PO4 0.2g 蒸馏水至 1000ml PBST（ 含0.05% Tween-20的PBS） 包被液（PH9.6，0.05M碳酸盐缓冲液） 封闭液：3％脱脂奶（3g脱脂奶/100mlPBS）， 底物显色液 柠檬酸（0.1M） 12.15ml Na2HPO4（0.2M） 12.85ml 邻苯二胺(l 双蒸水 25ml 总体积 50ml, 临用前加H2O2 兔抗血清：血吸虫感染动物实验获得，－20℃冻存备用 抗兔IgG－HRP 注：检测病人时用待测病人的血清，二抗则用抗人IgG-HRP 器材 分光光度计、酶标仪、超声粉碎仪、离心机等 主要步骤 日本血吸虫成虫及虫卵抗原的制备 收集上述感染动物（家兔）的虫卵及成虫，用适量的PBS稀释，超声粉碎后高速离心30 分钟，分别收集上清液，测定蛋白含量。 ELISA过程： 包被：以包被液稀释上述抗原成5ug/ml, 100ul/孔，4℃ 湿盒过夜 洗涤：以PBST洗涤5次 封闭：以3％脱脂奶封闭，300ul/孔，室温1小时 与抗血清反应：加入兔抗血清（1：400），100ul/孔，室温1小时 同上洗涤6次 与酶标二抗反应：加入羊抗兔IgG—HRP（1：5000），100ul/孔，室温1小时 同上洗涤6次 显色：加入显色液200ul/孔，室温半小时，避光 终止：以2N H2SO4 50ul 终止反应 实验结果观察和分析 OD490nm处读取结果（阳性反应呈棕色或棕黄色） 注意事项 严格实验操作，严防孔间交叉污染。 实验中要设定无抗原的空白对照、阳性对照和阴性对照。 第二部分 溶组织内阿米巴致病相关的功能实验 实验目的：掌握溶组织内阿米巴滋养体和包囊的形态特征及致病特征；熟悉溶组织内阿米巴滋养体的伪足运动、吞噬红细胞作用及阿米巴病的免疫学和分子生物学诊断方法；了解溶组织内阿米巴致病的分子特征和溶组织内阿米巴的培养方法。 实验一 溶组织内阿米巴吸附红细胞抑制实验 实验原理 溶组织内阿米巴滋养体可借助其一系列的致病因子侵袭宿主组织器官，尤其是半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素(Gal/GalNAc lectin)，可介导滋养体附着于宿主结肠上皮细胞等细胞表面，进一步引起细胞溶解、组织破坏并形成溃疡。 实验材料和方法 试剂 溶组织内阿米巴HM1?1MSS（标准株），美国NIH Dr