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基因克隆技术综述摘要：综述了基因克隆技术的发展历史、常用技术及最新进展，简述了各种技术的优缺点，展望了未来基因克隆技术的发展前景。关键词：基因克隆；基因克隆技术；目的基因提取；展望基因克隆技术是一种可以在短时间内大量复制特定基因的技术，它不仅对了解人类疾病发生发展的机制，进而探讨疾病的防治方法、手段、改善生命质量有重要价值，而且还可以用来兴旺生命科学工业(如制药业等),改良农作物、畜禽品种等，因此对现有基因克隆技术进行系统的研究和优化改进具有重要意义。现对现有的各种技术体系，正向遗传学途径及反向遗传学途径进行综述，以把握基因克隆技术的发展历程，并对未来发展趋势进行展望。相关概念克隆是指从一个共同的祖先通过无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊群体。基因克隆技术又称DNA重组技术，是指在体外，通过分子生物学的方法将目的基因与运载载体重组在一起，然后引入受体细胞，使目的基因在受体细胞中得到扩增并借助受体细胞获得目的基因的表达产物——蛋白质，从而达到对目的基因的生物学特性进行研究的技术方法 [1]。一般来说，基因克隆和基因工程二者含义相近，并无大的区别，前者强调目的基因的克隆过程，而后者着重于克隆工作的全局和整体。基因克隆技术研究历史回顾基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于20世纪70年代初期。美国斯坦福大学的伯格等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，制造了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科恩等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系[2]。克隆基因的常用技术一般来讲，基因的克隆途径可分为两种：正向遗传学途径和反向遗传学途径。前者是根据目标基因所表现的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的，主要包括功能性克隆技术和表型克隆技术；后者则着眼于基因本身，通过特定的序列或在基因组中的位置进行，包括定位克隆（图位克隆）技术、同源序列法克隆、转座子标签法克隆、基因芯片技术、表达序列标签技术（EST）和电子克隆技术等。下面我将简单地对它们一一介绍。3.1功能性克隆技术功能克隆（Functional Cloning）就是从蛋白质的功能着手进行基因克隆，是人类采用的第一个克隆基因的策略。其基本内容为：根据已知的生化缺陷或特征确认与该功能有关的蛋白质，分离纯化蛋白并测定出部分氨基酸序列，根据遗传密码推测其可能的编码序列，设计相应的核苷酸探针，杂交筛选cDNA文库或基因组文库，或者使用该蛋白质特异的抗体，筛选表达载体构建的cDNA文库，通过抗原抗体反应寻找特异的克隆，最后对选中的克隆测序，获得目的基因的序列[3]。用这一策略克隆基因的关键在于必须首先分离出一个纯的蛋白，测定出其一部分氨基酸序列或得到相应抗体；其次要构建cDNA文库或基因组文库；然后要对文库进行杂交筛选。随着生命科学研究的深入，以及蛋白质双向电泳技术和蛋白质测序技术的日趋成熟与完善，各种差异表达的蛋白质将被大量分离纯化，必将给功能克隆提供更好的条件，使之得到更加广泛的应用，功能克隆将会继续发挥其重要作用。3.2表型基因克隆法目前，有很多动植物，人们既不了解它们的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知动植物在表现型上存在着差异，利用表现型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关的基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。表型基因克隆法带动了许多新技术的发展，如：cDNA差式分析法（RDA）；标签接头竞争PCR技术（ATAC-PCR）；抑制消减杂交法（SSH）；基因表达连续分析法（SAGE），这些技术省去了分子标记、定位分析的连锁程序，可以分离出许多未知产物的表达基因。3.3定位克隆定位克隆技术（positional cloning）又叫图位克隆（map-based cloning），是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法，适合于克隆编码产物未知的基因。其基本原理是根据功能基因在基因组中存在相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目标基因两侧紧密连锁的分子标记筛选含有大的插入片段的基因组文库（如BAC 和YAC），用筛选到的阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群，再通过染色体步行（chromosomewalking）逐步逼近候选区域或通过染色体登陆（chro-mosome landing）的方法获得含有目标基因的大片段克隆，将含有目标基因的大片段克隆进行亚克隆，或以大片段