细胞生物学[第三章胞生物学研究方法]课程预习.docxVIP

第三章 胞生物学研究方法 一、细胞形态结构的观察方法 (一)光学显微镜技术 肉眼的分辨率一般只有0．2mm，光学显微镜的分辨率为0．2tam，而电子显微镜可达0．2lqm。光学显微镜技术(Light microscopy)至今仍然是不可缺少的方法，并且随着多种现代生物学技术与光镜技术的结合，使光学显微镜展示出了新的活力。 (1)普通复式光学显微镜技术。 普通光学显微镜(最大分辨率为0．2tam)，主要由三部分组成：①光学放大系统，即目镜和物镜；②照明系统；③机械和支架系统。显微镜的性能优劣决定于它的分辨率。分辨率是指显微镜区分开相近两点的能力。 (2)荧光显微镜技术。 利用样品自发荧光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染色后对活细胞进行研究。 (3)激光共焦点扫描显微镜技术。 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。它在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可以观察较厚样品的内部结构。 (4)相差显微镜技术和微分干涉显微镜技术。 光线在通过密度不同的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差(即明暗)。，从而提高样品反差，故样品不需染色，适合观察活细胞。甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它在结构上与普通显微镜最大的不同在于物镜后装有相差板。 微分干涉显微镜用的是偏振光，增加了样品反差，并具有立体感，可作于研究活体细胞中较大的细胞器。 (二)电子显微镜技术 电子显微镜在基本原理上与光学显微镜完全不同，构造也要比光学显微镜复杂得多，但其光路图却十分相近。 电镜与光镜的基本区别：电镜的高分辨率是因为使用了波长比可见光短得多的电子束作为光源，波长小于0．1nm。由于光源不同，决定了电镜与光镜的一系列不同点：①用电磁透镜聚焦；②电镜镜筒中要求高真空；③图像需用荧光屏来显示或感光胶片作记录。 电镜的分辨率与有效放大倍数：人眼分辨率一般为O．2mill；光镜分辨率为0．2tam左右，其放大倍数为0．2mm／0．2tam，即1000倍；电镜分辨率可达0．2nm，放大倍数为l06倍。 电镜主要由四部分组成：①电子束照明系统，包括电子枪、聚光镜；②成像系统，包括物镜、中间镜与投影镜等；③真空系统，用两级真空泵不断抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的高真空；④记录系统，电子成像须通过荧光屏显示用于观察，或用感光胶片记录下来。 (三)扫描隧道显微镜 扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope，STM)是IBM苏黎世实验室的Binnig、Rohrer、Gerber和Weible于1981年发明的。它是一种探测微观世界物质表面形貌的仪器。Binnig和Rohrer因此而获得1986年的诺贝尔物理学奖。 STM主要原理是利用了量子力学中的隧道效应，即通常在低压下，二电极之间具有很大的阻抗，阻止电流通过，称之为势叠。当二电极之间近到一定距离(100nm以内)时，电极之间产生了电流，称隧道电流，这种现象称隧道效应，并且隧道电流(I)和针尖与样品之间的间距(d)呈指数关系，这样d可转化为，的函数而被测定。 STM的主要装置包括实现X、Y、Z三个方向扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 STM的主要特点：①具有原子尺度的高分辨本领，侧分辨率为0．1～0．2nm，纵分辨率可达0．001 nm；②可以在真空、大气、液体(接近于生理环境的离子强度)等多种条件下工作；③非破坏性测量。 目前，STM作为一种新技术，已被广泛应用于生命科学各研究领域。人们已用STM直接观察到DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等的结构。与其功能类似的还有原子力显微镜(atomic force microscope)等十余种，统称为扫描探针显微镜。 二、细胞组分的分析方法 (一)用超速离心技术分离细胞器与生物大分子及其复合物 离心方法是分离和提取细胞亚显微结构和大分子的重要手段之一，根据颗粒在离心场中的沉降行为，离心的方法可归纳为以下两种： (1)沉降速度法。它包括差速离心法和区带离心法。该法主要根据颗粒大小、形状不同进行分离。 (2)等密度离心法。有离心自成等密度离心法和预制梯度离心法二种。该法是以颗粒密度差为基础进行分离的，与颗粒的大小、形状基本无关。用低渗匀浆、超声破碎或研磨等方法使细胞膜破损，形成各种细胞器和细胞组分的混合匀浆，再通过差速离心(differential centrifugation)，即利用不同的离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。 速度区带离心法是离心前在离心管内预先装入密度梯度的材料(如蔗糖、甘油、KCl和CsCl等)，待分离样品铺在梯度