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生命科学研究方法与规范课程论文小鼠大脑高表达M基因的分子进化分析及功能研究复旦大学生命科学学院生物化学与分子生物学专业题目小鼠大脑高表达M基因的分子进化分析及功能研究摘要小鼠大脑中存在一新的高表达基因M，基因M是转化生长因子A信号转导通路中的一个下游基因。有研究发现M基因的突变与人类听觉疾病有关，本研究采用分子进化手段分析M基因的保守性，发现该基因在哺乳动物中高度保守，且与人的同源基因相似度极高。为进一步阐明M基因的功能，通过免疫印迹及免疫组化方法研究该基因在小鼠不同器官中的表达情况，验证该基因仅在小鼠大脑中特异性高表达。进一步通过基因敲除技术研究该基因在小鼠的听觉系统中的功能，发现该基因敲除后会引起小鼠听力异常，证明该基因对小鼠听觉系统是必不可少的，为人类听力疾病治疗及新药筛选构建了动物模型。关键词 M基因 听力异常 基因敲除 分子进化研究背景基因M是新近发现的一个基因，是转化生长因子A信号转导通路中的一个重要基因。M蛋白是A信号转导下游的重要胞浆内信号级联分子，它与活化的受体激活型M分子形成复合物，移位到细胞核，与其他转录因子协同作用，将A信号从细胞膜传导到细胞核内，调节A应答基因的转录。A基因在胚胎发育、细胞生长、分化及凋亡方面发挥着重要作用。有研究表明，A基因的基因敲除小鼠存在内耳发育异常的现象[1]。本实验室前期研究发现，M蛋白在小鼠大脑中有高表达，编码该基因的突变可导致听力综合症的出现。据此我推测M基因与小鼠的听觉密切相关，但具体功能尚不明确。为了深入了解M基因，首先利用生物信息学方法，采用分子进化手段对该基因进行分析。分子进化是利用不同物种中同一基因序列的异同来研究生物的进化，构建进化树。既可以用DNA序列也可以用其编码的氨基酸序列来做，甚至于可通过相关蛋白质的结构比对来研究分子进化，其前提假定是相似种族在基因上具有相似性[2]。分子进化的研究可以为生物进化过程提供佐证，为深入研究进化机制提供重要依据。本研究计划拟采用蛋白质序列和核酸序列对该分子进行进化分析。将来自不同物种的序列进行多序列同时比较，确定该基因序列与其他哺乳动物对应序列的同源性，研究该基因在哺乳动物中的保守性，证明该基因在哺乳动物中高度保守，说明该基因功能较为重要。下一步根据序列同源性分析的结果，还可以构建系统进化树。而将该基因序列与其人同源基因序列进行两两比对，可以研究二者的相似性。也可从实验角度利用分子杂交方法比较二者基因序列的相似程度，确定它们之间的亲缘关系。为了进一步阐明M基因的功能，从反向遗传学入手，首先通过免疫印迹及免疫组化方法研究该基因在小鼠不同器官中的表达情况，验证该基因仅在小鼠大脑中高表达，进一步通过基因敲除技术研究该基因在小鼠的听觉系统中的功能，验证该基因对小鼠听觉系统是必不可少的。基因敲除技术是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一项技术[3]。通过将外源DNA的同源序列和活细胞内的染色体DNA发生同源重组，达到定点修饰改造染色体上某一特定基因[1]。通过对生物活体遗传信息的定向修饰并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而可以研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等 [4]。问题与方法M基因的分子进化分析1.1 蛋白质及cDNA序列获取从NCBI(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov)数据库中检索已发表的所有哺乳动物M基因的蛋白质序列及cDNA序列。具体操作程序为：(1)先获取各个物种的M基因的蛋白质序列；(2)将获得的不同物种M蛋白的序列以FASTA格式保存为文本文件（.txt）；(3)从蛋白质序列得到cDNA序列，包含起始密码子的第一个碱基到终止密码子的最后一个碱基。同样以FASTA格式保存。本研究拟获取l4种哺乳动物M基因的编码蛋白质序列及cDNA序列[3]。这里采用氨基酸序列分析是因为分子进化的一些重要原理 (如基因重复和分子钟) 都是通过研究氨基酸序列发现的。相比核苷酸序列，蛋白质序列较为保守，能为研究基因和物种的长期进化提供有用信息，再者对蛋白质编码基因的DNA序列对位排列时可能需要氨基酸序列校正。在进行分析时，氨基酸置换模型比核苷酸置换模型简单。1.2 M基因的进化分析利用MEGA4软件，对上述14个物种M基因的蛋白质序列进行多重比对分析，采用邻接法(neighbor joining，NJ)构建进化树。进化树各分支单位置信度通过Bootstrap法检验．共1000个循环[5]。预期结果为多重比对分析发现不同物种间M基因高度保守，同源性较高，说明该基因在哺乳动物中高度保守。构建的进化树Bootstrap的值70，较为可靠，且该