第6章 转基因动物.pptVIP

第六章 转基因动物 6.1 动物的转基因技术 6.2 转基因动物的筛选与检测 6.3 转基因动物的现状与应用 转基因动物（transgenic animal）：是指借助基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之在受体染色体上稳定整合，并能把外源目的基因传给子代的个体。 转基因动物：指人类按照自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内，通过与染色体基因组进行稳定的整合，将生物性状传递给后代动物。 6.1 动物的转基因技术 关键技术： ①目的基因分离； ②与启动子、增强子、报告基因等拼接重组； ③导入生殖或胚胎干细胞； ④胚胎移植技术（embryo transfer,ET）； ⑤胚胎发育、生长及鉴定筛选； ⑥目的基因整合率及表达效率的检测。 转基因动物的制备方法 1、显微注射法：最为经典、常用 随机整合，效率低；导致外源基因表达效率不高 2、逆转录病毒法： 3、胚胎干细胞法（ES法）： 4、体细胞核转移法（NT）：多莉 哺乳动物基因表达载体的组成特征 1、在哺乳动物细胞中进行基因转录的元件，即启动子、增强子、终止子、poly(A)信号、内含子剪切信号等 2、选择标记 3、在细菌中进行复制和筛选的元件 4、基因表达的调控元件 哺乳动物基因克隆载体 猿猴空泡病毒40：含DNA的病毒，含双链闭合环状的DNA分子。 能感染猿猴等哺乳动物，是用于构建哺乳动物基因克隆载体的少数病毒之一。但对人是安全的。 哺乳动物细胞基因表达系统 外源基因在哺乳动物中的表达：基因的转录、mRNA翻译及翻译后蛋白质加工等。 翻译后蛋白质加工包括：蛋白质的糖基化、磷酸化、寡聚体形成、二硫键的形成等。 哺乳动物基因表达宿主细胞 选择基本原则：来源丰富、转化效率高、表达效果好。 在哺乳动物基因表达过程中，与正常细胞生理特征尽可能接近的肿瘤细胞常被作为基因转移的受体细胞。 CHO-K1细胞、COS-7细胞、Hela细胞、 鼠骨髓瘤细胞Sp2/0等 6.2 转基因动物的筛选与检测 1 报告基因：GFP、CAT、lacZ‘、LUC 2 分子生物学检测方法： 基因水平：PCR、Southern 转录水平：Northern、RT-PCR 蛋白水平：Western、ELISA 利用遗传选择标记筛选哺乳动物细胞 Cat、NptⅡ A：tk(胸苷激酶基因) B：dhfr（二氢叶酸还原酶基因） C：ecogpt（黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因）等。 A：胸苷激酶（TK）基因 TK：能使胸苷转化为胸苷-磷酸(胸苷磷酸化)，保证核苷酸合成顺利进行。 HAT选择法：选择培养基含有次黄嘌呤（hypoxanthine）、氨基蝶呤（aminopterin）、胸苷（thymidine）。 体内嘌呤核苷酸形成的两条途径 从头合成途径（salvage pathway）：利用磷酸、核糖、氨基酸、一碳单位（如甲酰基，来自四氢叶酸）及CO2等简单物，经过一系列酶促反应合成。 肝 补救合成途径（denovo pathway）：利用体内游离的嘌呤或嘌呤核苷，经过简单反应合成。 脑、骨髓 腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤为底物 嘌呤核苷为底物 HAT选择法基本原理 ①培养基中的叶酸类似物氨基蝶呤（APT）阻断细胞核苷酸的全程合成途径，启动以次黄嘌呤（H）为底物的补救合成途径，该途径不受氨基蝶呤的抑制，继续合成出所需核苷酸。→→→APT作用 ②由于在HAT培养基中补加有外源的胸苷(T)，通过胸苷激酶（TK）的作用，tk+细胞能以其为底物合成TTP，所以tk+细胞可以继续存活下去； ③而tk -细胞则不会进行这种合成作用，因而死亡。 6.3 转基因动物的现状与应用6.3.3 转基因技术在动物育种中的运用 ①提高动物的繁育速度。 生长激素、类胰岛素生长因子-1 ②改善动物品质。 不耐乳糖 ③培养抗病害动物品系。 6.3.4 转基因动物在医学研究中的运用 1、建立各种疾病模型 2、在改造移植器官中的运用 3、在新药开发及疾病治疗中的运用 动物模型筛选药物：可以大大提高筛选药物的准确性、缩短试验时间、减少试验次数、降低筛选成本。 用于抗肿瘤、抗艾滋病、抗肝病等药物筛选 ①利用转基因动物筛选抗肿瘤药物 多药转运系统：人体多药耐药性（MDR）基因编码表达的能量依赖性药物排出泵能将许多天然细胞毒药物排出细胞外。 MDR转基因动物模型的建立为抗肿瘤药物的研究提供了一个简单而有效的模型 可以模拟人类肿瘤对药物的代谢 在新的抗肿瘤药物筛选、剂量限制、毒性研究中发挥重要作用。 ②利用转基因动物筛选抗艾滋病病毒药物 HIV对宿主的选择性很高，只有长臂猿和黑猩猩对HIV敏感，但不能用于生物医学研究。 人工免疫缺陷鼠和