实验三血清蛋白等电聚焦电泳.pptx

实验三：血清蛋白电泳电泳基本原理：电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷， 因此可以用电泳技术分离和鉴定。 COO- COO- COOH╱ + H+ ╱ + H+ ╱Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+PH>PI PH=PI PH<PI带电粒子的迁移率电场力 F=XQ （X：电场强度， Q：电荷量）阻力 F=6π γ ηv （γ：半径，η：介质粘度） 当电泳颗粒匀速运动:F= F?QX=6πγηνν/X=Q/6πηγν/X 用U表示，称迁移率（mobility）,即带电颗粒在单位电场强度下的移动速度迁移率，取决于带电粒子的电荷量Q 、粒子大小γ和形状。Q越多，V越大；r越小，V越大；球形分子>纤维状影响电泳速度的因素：样品本身：带电量，分子大小，形状电场强度：电压电泳介质的pH和离子强度电渗作用 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳分类按凝胶装置分为盘状电泳及板状电泳盘状电泳通常是不连续系统，利用缓冲液离子成分、pH、凝胶孔径进行电泳，带电颗粒电泳时具有电荷效应、分子筛效应、 浓缩效应。聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反应：以聚丙烯酰胺作为支持介质的一种电泳技术。凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED, 形成三维网状凝胶。三大效应：浓缩效应 缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液，样品及浓缩胶中为pH6.7 Tris-HCL缓冲液。甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。实验步骤1.制备PAGE胶柱 画线，封口：在一端取7cm和7.5cm两处画线，此 端管口插入橡皮垫。 制备分离胶：配制好7.5%分离胶，缓慢注入玻璃管 7cm处，加水防止氧化，室温下聚合 20-30min。 制备浓缩胶：配制好4.5%浓缩胶。将胶上层水倾倒出 去，用滤纸吸干余水。加浓缩胶，封 水。室温下聚合20-30min。试剂分离胶（ml）浓缩胶（ml）分离胶缓冲液1.25-单体交联剂2.51.5浓缩胶缓冲液-1.24蒸馏水6.157.16催化剂0.10.1TEMED0.020.03总体积约10约10丙烯酰胺浓度7.54.5 2. 上样和电泳：将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡, 加样品液50μl至浓缩胶面。加电解液直至装满上电泳槽。电泳约1.5hr。 3. 染色，观察结果：将胶从玻璃管中取出，注意不要弄断凝胶。凝胶考马斯亮蓝染色，然后脱色，脱色至背景清晰。观察结果。结果示意图：γ β α2α1清蛋白血清蛋白质的等电聚焦电泳原理等电聚焦凝胶电泳是依据蛋白质分子的静电荷或等电点进行分离的技术，等电聚焦中，蛋白质分子在含有载体两性电解质形成的一个连续而稳定的线性pH梯度中电泳。载体两性电解质是脂肪族多氨基多羧酸，在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续的pH梯度。蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。 条件:两性载体电解质产生pH梯度 Ampholine的性质：两性电解质组成：由丙氨酸和多已烯多胺加和而成pH范围：3-10特点：电泳后形成几乎线性的连续PH梯度实验步骤配制样品胶制备电泳柱 混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至约10cm高度，在胶面上再覆盖1cm厚的覆盖液