实验十 Western blot 潘銮凤.pptx

实验十 Western blot潘銮凤用来检测蛋白质的一种技术 一、实验目的掌握SDS直接裂解细胞法提取蛋白质掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理掌握SDS分离蛋白质的原理和技术掌握半干转移的操作和Western blot 的原理和技术Western blot总蛋白质制备 细胞裂解 蛋白质溶液 SDS电泳分离蛋白质 SDS-蛋白质复合物 蛋白分离形成条带 转 膜 蛋白质 from 凝胶 to PVDF膜 在PVDF膜上鉴定蛋白质封闭一抗结合酶标二抗结合显色二、实验原理细胞总蛋白的制备(SDS裂解法)SDS电泳(不连续系统)转膜(半干转移法)在PVDF膜上鉴定蛋白质(抗原-抗体反应)1.细胞总蛋白的制备从细胞中提取出蛋白质的方法： 1)机械破碎：匀浆器，超声波，石英砂 2)去污剂：SDS，NP-40等 3)酶消化法：溶菌酶，纤维素酶 4)其他：高压挤压，反复冻融从组织中提取蛋白质： 剪成小块，液氮中研磨，去污剂中溶解 Lowry法测定总蛋白质浓度试剂A：碱性铜试剂试剂B：磷钼酸、磷钨酸 1）蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色蛋白质-铜复合物 2）紫红色复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原磷钼酸和磷钨酸，产生深蓝色，呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，分光光度计测吸光度，做标准曲线2.SDS分离蛋白质SDS的作用: ① 裂解细胞膜、解离蛋白质之间的氢键、 取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠 ②蛋白质-SDS复合物（1g : 1.4g）,长椭圆棒形 掩盖了蛋白质原有电荷差别 迁移率是分子量的函数??聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）优点：机械强度好，有弹性，透明，对pH变化和温度变化较稳定，几乎没有吸附和电渗作用。通过改变浓度可以改变胶的孔径，用于蛋白分离。蛋白质的PAGE分离不连续体系由电泳缓冲液，浓缩胶，分离胶组成1）浓缩胶为大孔径胶，凝胶缓冲液pH6.7的Tris-HCI2）分离胶为小孔径胶，凝胶缓冲液pH8.9的Tris-HCI3）电泳缓冲液pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液NH2CH2COO-浓缩胶(浓缩效应)SDS-蛋白复合物 Cl-SDS-蛋白复合物NH2CH2COO-分离胶(分子筛效应) Cl- 分离凝胶浓度与蛋白分子量范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212 3.转膜(半干转移)蛋白质带负电，电场中会往正极移动PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上 转膜 半干转移“三明治”4.PVDF膜上鉴定蛋白质4.PVDF膜上鉴定蛋白质显色系统：IgG-HRP DAB/H2O2 （辣根过氧化物酶 四氢氯化二氨基联苯胺/过氧化氢） 结果呈棕色。 反应稳定，价廉，但灵敏度低。IgG-AKP BCIP/NBT（碱性磷酸酶 5-嗅4-氯3-吲哚磷酸盐/四唑氮盐） 结果呈蓝紫色。 反应不稳定，昂贵，但灵敏度高。3.化学发光显色法 三、实验器材与试剂（详见实验讲义?）电泳槽浓缩胶分离胶半干转移电泳槽四、实验内容制分离胶 P37.四.4细胞总蛋白的制备 P34.四.1(1-6)制浓缩胶 P38.四.5上样电泳 P38.四.8-9染色 P39.10-11转膜 P41.四.2(转膜缓冲液临用前加入15ml甲醇混匀)封闭结束，余下步骤在Western blot （二）完成安装配胶装置松开本体的四个螺栓，向外侧拉开滑块。 安装配胶装置将一对玻璃板底端对齐，带凹口的玻璃板向内安装配胶装置玻璃板放在本体底部的支架上，底端对齐；玻璃板的两侧放入本体两侧的边条之间。向内推进滑块，拧紧螺丝安装配胶装置将制胶架凸轮往两边拉开，放入本体，插入并旋紧凸轮使玻璃板底部压紧。10%分离胶溶液（ P37.四.4，体积减半）15ml（两块板）30% 丙烯酰胺5 ml4×分离胶缓冲液3.75 ml10% SDS0.15 ml10% 过硫酸铵75μlTEMED5μlddH2O6.05 ml立即混匀沿着短玻璃的上缘缓慢倒入两个玻璃板之间，直至液面达到距梳子下缘约1cm处将0.5 ml左右水饱和的正丁醇加在分离胶液面上浓缩胶分离胶将0.5 ml左右水饱和的正丁醇加在分离胶液面上4%浓缩胶溶液弃去正丁醇，用ddH2O冲洗分离胶的胶面混匀浓缩胶溶液，缓慢倒入分离胶上，直至液面达到短玻璃的上缘小心地插入梳子，注意赶走气泡10ml30% 丙烯酰胺1.32ml4×浓缩胶缓冲液2.5ml10% SDS0.1 ml10% 过硫酸铵50μlTEMED5μlddH2O6.0 ml细胞总蛋白的制备 P34.四.1(1-7)制备细胞总蛋白（一）取1瓶HL60细胞，用滴管吹打成单细胞，转入15ml离心管。4℃ 3000 rpm 离心5 mi