实验七+Southern+blot2014-9潘銮凤.pptx

实验八Southern blot 实验目的：学习核酸杂交的基本过程和操作Southern blot应用： 目的基因检测，定性 基因拷贝数，定量基因诊断、病理机制研究、同源性分析核酸杂交方法Southern blot: DNANorthern blot: RNA原位杂交：组织、细胞、菌落、染色体斑点杂交液相杂交芯片实验流程图基因重组与转化重组质粒提取与鉴定质粒大量制备探针制备Southern blot细胞培养基因组DNA制备DNA浓度测定酶切PCR实验原理Southern杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测杂交探针：基因组cDNARNA寡核苷酸待检基因核酸变性杂交：碱基互补连续4bp形成双链连续17bp人基因特异杂交复性（杂交）实验原理 Southern blot 过程细胞(组织)基因组DNA制备限制性酶切电泳分离转移并固定于膜上与标记探针杂交杂交结果检测凝胶电泳标记marker 待检基因组放射自显影荧光酶催化显色变性转移与标记探针杂交印迹到尼龙膜上（看不见条带）洗膜探针制备转膜后杂交检测杂交结果的检测(5-溴-4氯-3-吲哚磷酸盐)(氮蓝四唑)实验步骤基因组DNA经酶切成小片段（EcoR I或 Hind III）电泳分开各片段（1％琼脂糖凝胶电泳）变性（双链经碱变性解开成两条单链）转膜及固定（DNA经毛细管作用转移到尼龙膜上，紫外交联固定）预杂交（减少标记探针的非特异性结合，小分子鲑精DNA为竞争性封闭剂）杂交（靶DNA单链与DIG标记的c-myc探针之间以碱基互补的原则进行杂交）洗膜（洗去未与靶DNA结合的探针）检测（杂交条带通过抗-DIG-碱性磷酸酶及其酶底物显色）1d1d1d实验步骤一. 基因组DNA的限制性内切酶酶切HL60基因组DNA 10 mg 16 ml10×Buffer E 2 mlEcoR I（10 u/ml）2 ml总体积20 ml37℃保温1.5小时。组2二. 1％琼脂糖电泳两组共用一块凝胶，共7个样1.基因组DNA10 20ml （自己的）2.基因组DNA10 mg（老师的）3.酶切样品4.阳性对照（c-myc 4.7 kb线性片段，30pg/ml, 10ml)5.酶切样品6.基因组DNA10 mg （老师的）7.基因组DNA10 20ml （自己的）组1实验步骤三.变性切胶，2—6孔，宽4.5cm,长7cm(从顶部开始，可用尼龙膜保护纸作为标尺）将凝胶浸在5倍体积的胶变性液中, 慢慢摇动20分钟。ddH2O洗2次。在胶中和液中慢慢摇动15分钟。实验步骤四.转移在搪瓷盘中加入300ml10×SSC，放上培养皿和小玻璃板实验步骤将3张长滤纸浸湿，逐张放在玻璃板上，用移液管的滚动，赶走气泡实验步骤切除多余凝胶，小心地将凝胶放在滤纸上，赶走滤纸与胶之间的气泡实验步骤再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上，同样不能有气泡，然后放上三张浸湿的滤纸，赶走气泡实验步骤紧贴凝胶四周各放一张X光片实验步骤小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸，但不能让滤纸移动实验步骤用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处，轻轻割断保鲜膜，但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜实验步骤整齐地放上草纸，数张草纸一折二，草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm实验步骤在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜实验步骤五.固定将胶和尼龙膜一起翻过来,用铅笔深入加样槽在尼龙膜上画上槽的位置 正面朝上放在紫外交联仪中（909室），交联固定ddH2O稍加漂洗后空气中自然干燥实验步骤六.杂交和洗膜将尼龙膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭6小时。倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。回收杂交液 (可重复使用), 将膜放在洗膜溶液I中,室温洗2次,每次摇动5分钟。再在洗膜溶液II中(60℃预热后直接倒进表面皿),洗2次, 每次摇动15分钟。实验步骤七.检测将膜在缓冲液1中漂洗3分钟。在缓冲液2中室温摇动封闭30分钟。在含anti-DIG-AP的抗体溶液中室温摇动，孵育30分钟。（做密闭袋，先放膜，后封边，再加入抗体溶液，以1.0μl加入5ml 缓冲液2配成，最后封口）用洗膜溶液III(马来酸缓冲液，0.3%吐温)洗2次, 每次15分钟。在缓冲液3（检测缓冲液）中平衡3分钟。将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5——16小时。（以100μl加入5ml检测缓冲液配制）当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE或ddH2O洗去底物液，拍照并干燥保存。 影响杂交的因素1）待检核酸分子的浓度和长度 浓度越大,复性速度越快,敏感性↑;