基因的重组与转移课件.pptVIP

第六章 基因的重组与转移 1. 两段DNA的连接 2. DNA片段与载体的连接 (二)平齐末端（blunt end）的连接 2. 人工加尾形成 “粘性末端” （2）连接子(linker)连接 ③优点： （3）DNA接头 (adapter)连接法 (三)PCR产物的连接 引物1 引物2 带酶切位点的PCR产物 2. 与T载体直接连接 (四)DNA体外连接应注意的事项 （1）用相同的酶切 2. DNA插入的方向正确 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 4. 防止载体自身环化连接 (五)载体和外源DNA插入片段的连接结果 第二节 重组体导入细菌细胞 2. 菌种 3. 制备原理 4. 制备过程 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）热休克法 （2）电转化法 5. 平板培养基培养细菌 6. 影响转化率的因素 （2）感受态细胞 （competent cells) 7. 体外包装的噬菌体的转导 （3）cI857基因突变的?噬菌体 （4） 互补型噬菌体 (5) 体外包装过程 （6） 转导 第三节 外源基因导入植物细胞 2. 电击法（electroporation) 3.基因枪法（gene gun） 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接。 尽量避免平端连接。 决不能进行非粘性末端连接。 EcoRI EcoRI EcoRI （2）用同尾酶切 BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端。 （1）用双酶切 由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI （1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ （1）提高插入片断的用量 连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片断 （4）使用同尾酶产生的粘性末端连接方法 酶切反应后不必将核酸内切酶失活再进行连接反应 （3）采用同聚物加尾连接技术 线状DNA分子的两个3’-OH末端具有同样的碱基结构 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 17 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 一、感受态大肠杆菌的制备 什么是感受态？ 就是细菌吸收转化因子的生理状态。 使用丧失了限制体系的大肠杆菌； 具有与重组体互补的遗传性状； 重组整合缺陷型。 用低渗CaCl2溶液在低温时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面，促进细胞对DNA的吸收。 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 30 min 4℃离心收集菌 用冰冷的0.01MCaCl2重悬 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存 On ice 20 min 用冰冷的0.01MCaCl2重悬 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 2. 转化率 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. DNA分子的转化过程 ① 吸附:完整的双链DNA吸附在受体菌表面 ② 转入:双链DNA分子解链 单链DNA进入受体菌,另一链降解 ③ 自稳:单链DNA在细胞内复制成双链环状 ④ 表达:外源基因同复制子同时复制、转录、翻译 4. 转化方法 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 50ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置30分钟 42oC 90秒 加入800 ?L LB培养基 37℃摇45min 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2 ℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 ℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 ℃离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,2