2009综合性实验：传代细胞培养及其增殖试卷.ppt

综合性实验：传代细胞培养及其增殖动力学检测 . 实验目的要求： 了解动物细胞培养的基本操作过程 学习传代细胞的传代方法 观察体外培养细胞在不同时期的形态变化及生长状况。 细胞培养 细胞培养(cell culture)是指从体内组织取出细胞，在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。 培养细胞的生存条件：无菌环境、温度（36.5±5℃）、渗透压（260-320mosM/kg）、pH条件（7.0-7.2）、气体条件（O2、CO2）、营养条件（氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐等）等 细胞培养条件 细胞培养所用仪器设备 无菌操作条件 1.细胞培养用品要经高压灭菌后才能使用； 2.培养用液要经过滤除菌处理；(培养液中还有活性成分血清，如果用高压灭菌会使成分失活，用特制的滤膜可防止细菌等通过) 3.实验过程要严格按照无菌操作规程进行。 1. 培养用品的清洗、包装和灭菌 清洗 玻璃器皿的清洗 步骤：浸泡→刷洗→浸酸→冲洗→ 干燥箱中烘干。 塑料器皿清洗 自来水充分浸泡→冲洗→2%NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水洗→去离子水洗→蒸馏水漂洗3次→晾干 包装 瓶类：铝箔纸罩以瓶口 大中小枪头盒：两层报纸包装 离心管、冻存管：铝箔纸罩以管口，两层报纸包装 金属器械（解剖工具）：装入饭盒，再以报纸包装 灭菌 蒸汽灭菌、 滤过除菌 、紫外线 2. 培养液的配制和除菌 pH：7.2 添加双抗和小牛血清 过滤除菌 4℃保存 3.无菌操作 无菌室定期清洗消毒一次。 所用物品要一次性准备好。 实验进行前，无菌室及超净工作台以紫外灯照射30分钟灭菌，以75 %乙醇擦拭无菌操作台面，并开启风扇运转3-5分钟后，才开始实验操作。 每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。实验灭菌用品以75%乙醇擦拭后才带入工作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。瓶口要用酒精火焰消毒，勿碰触移液器吸头部分或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。 传代细胞培养 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养） 传代培养：是将培养的一定密度的细胞分散后，以1：2或以上比例转移，接种到另一个或几个容器中进行继续培养的过程。 传代培养的步骤： 1）将长满细胞的培养皿中原来的培养液弃去；加入新鲜的无血清培养液1ml轻轻冲洗细胞。 2）加入1ml0.25%胰蛋白酶溶液，使培养皿内的细胞都浸入溶液中。 3）将培养皿置于倒置显微镜下观察，随着时间的推移，细胞之间出现裂隙，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰蛋白酶吸出，加入2ml含血清1640培养液终止消化。 4）用移液器将贴壁的细胞轻轻反复吹打成细胞悬液，补充适量培养液后，分至2-3个培养皿中继续培养。 5）观察：细胞传代后，每天应对培养细胞进行观察，注意有无污染、培养液的颜色变化、细胞贴壁、生长情况。（短片） 体外培养细胞的生长过程 游离期 吸附（贴壁）期：培养后7-8h 繁殖期：细胞呈对数增长，培养12-24h后至3d内 维持期 衰退期 MTT法测定细胞增殖 噻唑蓝染色光吸收实验法是近年来在国内外广泛用于分析药物对细胞作用的方法.MTT的四氮唑环可被活细胞线粒体的乳酸脱氢酶催化形成MTT-甲复合物（橙色），形成的颜色溶于DMSO后，浓度越高颜色越深，该颜色深度可由酶标仪或分光光度计在给定波长下的吸收值确定，因此该复合物浓度的高低反映了细胞线粒体的功能状态以及它的能量代谢水平。也就反映了细胞的数量和生长状态。 ????? MTT法测定细胞增殖 （1）传代培养细胞，调整细胞悬液浓度至1×106个/ml ，以细胞液系列稀释细胞，浓度自1×106 /ml至1×103 /ml。 （2）将各浓度细胞悬液按100μl/孔接入96孔细胞培养板，每一浓度接4-6个平行，细胞贴壁培养24小时。 （3）加入20μlMTT试剂后，培养板重新置于培养箱中，温育3-4小时。 （4）每隔一定时间，取板，在倒置显微镜下观察细胞内是否出现紫色点状沉淀。 MTT法测定细胞增殖 （5）当紫色点状沉淀在显微镜下清晰可见时，包括空白对照孔在内的所有孔内加入洗涤剂（DMSO），每孔150μl。 （6）于酶标仪490nm下检测各孔吸收值。可选择550至600nm之间的任一波长检测吸收值。空白对照孔的吸收值应接近于0。 （7）若读数过低，需将板继续避光温育。 （8）计算几个平行的平均值，减去空白对照孔