转基因植物表达的RTPCR检测.pptVIP

转基因植物表达的RT-PCR检测 仪器 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。 试剂 RNA 反转录酶，3U/μL Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2 free），25mM MgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌dd water。 RT-PCR全过程 【结果与分析】 利用凝胶成像分析仪对电泳结果进行拍照和结果记录； 观察胶上是否有预扩增的主要产物带。对比目的基因产物的电泳谱带分子量和谱带的特异性，确定和描述谱带特征。 RT-PCR扩增得到的810bp的目的基因产物的电泳结果 实验中应注意的问题 RNA提取过程中防止降解 去除DNA的污染 实验中注意设置阴性对照 在冰上操作 思考题 结合实验结果，试论应用RT-PCR研究外源基因转录表达的优缺点。 * * 实验原理 　RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA 为模板进行逆转录反应（reverse transcription， RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。 RNA扩增包括两个步骤： 在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并