2016-5基因工程及其应用精要.ppt

如何获得目的基因？ cDNA基因克隆 基因组 DNA 文库 限制性内切酶消化 机械随机切割 PCR方法获得目的基因 五 基因工程的常用技术和方法 （一）cDNA基因克隆 cDNA文库是指得到足够多的分别克隆的cDNA片段，汇集这些克隆应包含某种细胞中各种mRNA的相应顺序，每种顺序至少有一份拷贝，这种克隆片段的汇集体称为某种细胞的cDNA文库。 1、没有原核生物的cDNA 文库 原核生物的 mRNA 非常不稳定； 原核生物的基因组文库比较容易构建，能包含所有基因的序列。 ２、cDNA 文库对于真核生物的基因分析 cDNA文库是只含有编码蛋白的基因文库 cDNAs 没有内含子 ? 基因可以在E. coli 中直接表达 得到mRNA 反转录获得cDNA ３、mRNA 分离原理 １） 传统的分离方法是用oligo (dT)-纤维素柱分离总RNA ２） 把oligo(dT) -磁珠同总RNA混合，在强磁场下分离mRNA ３）用蔗糖梯度离心mRNA核糖体复合体（溶解细胞）来分离mRNA ４、三种分离mRNA的方法 （二）基因组 DNA 文库 纯化基因组DNA 基因组DNA的片断化:物理切割和限制性内切酶 eukaryotes:从细胞核中去