抗褐化剂对荻外植体褐化和愈伤组织生长的影响.docVIP

抗褐化剂对荻外植体褐化和愈伤组织生长的影响 　　摘要：以荻（Miscanthus sacchariflorus）幼穗和诱导出的愈伤组织为材料探讨抗褐化剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、抗坏血酸（Vc）、柠檬酸（CA）对外植体和愈伤组织抗褐化作用，以及愈伤诱导率及愈伤生长速度的影响。结果表明，3种抗褐化剂都能抑制外植体和愈伤组织褐化，并提高愈伤组织诱导率。添加0.2 g/L PVP时荻外植体的褐变程度最低，0.2 g/L CA时愈伤组织诱导率最高，为91.1%，向愈伤组织继代培养基中添加0.2 g/L的Vc愈伤组织重量增加倍数最高，为21.38倍，且愈伤组织褐化率低为25.8%。 　　关键词：荻；抗褐化剂；褐化；愈伤生长 　　中图分类号：Q 946文献标识码：A文章编号2015 　　收稿日期 修回日期 　　基金项目：国家863计划项目（2012A资助 　　作者简介：彭思佳（1990），女，土家族，湖南保靖人，在读硕士研究生。 　　Email：psj0945@163.com 　　蒋建雄为通讯作者。 　　荻（Miscanthus sacchariflorus）系禾本科黍亚科芒属多年生的C4植物，具有生长速度快、生物质产量高、纤维品质好、适应性广等优良特点[1]。荻主要分布于我国长江以北的广大地区，野生资源数量及遗传多样性丰富。在北方干旱、半干旱地区，利用荻干物质发展生物质能源产业具有广阔的前景[2，3]。芒属植物为高度自交不亲和植物，有性繁殖后代个体间变异较大，因此，生产上荻的种苗繁殖主要采用扦插、分蔸等无性繁殖方式[4，5]，但是，这些无性繁殖方法的繁殖系数有限，育种缓慢[6]，满足不了产业发展的需求，而植物组织培养技术不仅种苗繁殖系数大、可实现规模化生产，并且也是进一步开展多倍体诱导和转基因领域研究的基础。 　　荻的外植体在离体培养过程中极易褐化，会影响愈伤组织的诱导和生长，严重时导致死亡。在植物组织培养中的褐化现象主要由酶促褐变引起[7]，目前已知过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）在酶促褐化过程中起主要作用，当组织中多酚氧化酶被激活，酚类物质将被氧化形成褐色的醌类物质[8，9]。在植物组织培养过程中通过采取措施，例如添加抗氧化剂、对外植体材料进行前处理和及时更换新鲜培养基等可以防止或减缓褐化现象，其中添加适宜的抗褐化剂既能抑制褐化也有利于愈伤组织生长[10]。试验以荻幼穗和愈伤组织为试验材料，研究不同抗褐化剂对荻愈伤组织诱导及继代的影响，旨在筛选能提高愈伤组织诱导率和生长率的最佳抗褐化剂，以期建立高效的无性繁殖体系，为今后开展多倍体诱导、转基因和体细胞诱变等遗传改良和种质创新研究奠定基础。 　　1材料和方法 　　1.1试验材料 　　试验材料采自河北井陉的野生二倍体荻，现种植于湖南农业大学芒属植物资源圃，于秋季采荻孕穗期新鲜幼穗作为外植体。 　　1.2方法 　　1.2.1外植体的准备晴天上午10∶00取颖花原基形成期和花粉母细胞形成期（旗叶抽出长度2～3 cm时）大小一致的幼穗于4℃冰箱避光冷藏。24 h后取出幼穗，剥去叶鞘和外层苞叶，保留旗叶。在无菌环境下用浓度为75%的酒精擦拭幼穗表面，再用0.1%（w/v）升汞灭菌15 min，最后用无菌水清洗4～5次[11-13]。 　　1.2.2培养基愈伤组织诱导培养基MS+2 mg/L 2，4D+0.5 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉。愈伤组织继代培养基MS+2 mg/L 2，4D+0.1 mg/L 6BA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂粉，pH 5.8。在2种培养基中，分别添加过滤灭菌的3种抗褐化剂聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸和柠檬酸（表1）。 　　表1试验处理添加抗褐化剂类型及浓度 　　Table 1The types and concentrations of antioxidants 　　处理抗褐化剂类型浓度/g?L-1CK-01PVP0.22PVP0.63PVP1.04Vc0.15Vc0.26Vc0.47CA0.18CA0.29CA愈伤组织诱导无菌环境剥离幼穗，将其切割成0.5 cm长短，并接入添加不同浓度的PVP，Vc或CA的愈伤诱导培养基中，使外植体尽量平铺整个培养皿。每个处理重复3次，在25℃下暗培养。每隔5 d观察记录1次外植体褐化和愈伤诱导状况，30 d统计愈伤组织诱导率。 　　1.2.4愈伤组织继代培养将幼穗诱导出的愈伤组织在愈伤继代培养基中按表1添加不浓度的PVP，Vc或CA，每个处理各接入10块大小相对均匀的愈伤组织，并称重，重复3次。每隔7 d称重1次并观察统计愈伤组织的褐化情况，培养35 d