实验五、碱性磷酸酶米氏常数的测定课件.pptVIP

实验五 碱性磷酸酶米氏常数的测定 一、目的要求 1.学习分光光度法测定的原理和方法 2.学习和掌握米氏常数（Km）及最大反应速度（Vm）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶在以对硝基苯酚磷酸为底物时的Km 和Vm值。 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1．原理 2．主要方法： （1）比较吸收光谱曲线 （2）比较最大吸收波长 蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最大吸收波长为260nm。 1.苯丙氨酸 2.酪氨酸 3.色氨酸 （3）比较吸光度的比值 纯DNA （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1．原理 Beer-Lambert（比尔）定律： T=I/I0 A=lg1/T=lgI0/I A=KCL 其中：T为透光率；A为吸光率；I0为入射光强度；I为透射光强度； K为吸收系数；C为溶液浓度；L为溶液光程的厚度 2．常用方法 （1）标准曲线法 OD或Ａ 　　　　　　　　　　　　　　　　　浓度 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （2）标准管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，测定AS、AX，可求得CX。 （3）摩尔吸光系数法 C=A/?（?为L=1cm，C为1 mol/L时的吸光系数，也称为摩尔