超氧化物歧化酶方案.ppt

模板来自于 * 酶的提取与分离纯化 生工131 王国东 201311805115 主要内容 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 5、酶的组合分离纯化策略 6、酶的浓缩、干燥与结晶 1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 动物、植物或微生物细胞 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。 2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。 (1)机械破碎 (2)物理破碎 (3)化学破碎 (4)酶解破碎 JY92-II D超声波 细胞粉碎机 细胞破碎珠 高压细胞破碎机 细胞破碎方法及其原理 机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 表面活性剂 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎 3 酶的提取 方法 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.02～0.5mol/L盐溶液 提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶 酸溶液提取 pH2～6 水溶液 提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶 碱溶液提取 pH8～12 水溶液 提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶 有机溶剂提取 与水混溶的有机溶剂 提取与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶 3 酶的提取 影响因素 主要影响因素：酶在所使用的溶剂中的溶解度 酶向溶剂相中扩散速度 另外：温度-适当提高温度 pH值-避开酶的等电点 提取液体积-为原料体积的3～5倍，分几次提取 适当搅拌、适当延长提取时间、适当加入保护剂 4 酶的分离方法 4.1 沉淀分离 4.2 离心分离 4.3 过滤与膜分离 4.4 层析分离 4.5 电泳分离 4.6 萃取分离 纯化方案的设计 纯化方法的选择依据——根据有效成分和杂质之间理化性质的差异 纯化方法的排序——先选用粗放、快速、有利于缩小样品体积的方法。精确、费时、需样品少的方法，宜后选用。 5 酶的组合分离纯化策略 5 酶的分离方法 注意 （1）各种酶的纯化方法都有其固有的优缺点 在设计某一酶的纯化线路时，应考虑各种因素对选用的纯化方法及先后次序的影响。 （2）初步纯化（rough fractionation） 除去与目的产物性质差异很大的杂质。 （3）高度纯化（fine fractionation） （精制） 除去与产物性质相似的杂质。 (1) 粗酶 : 采样 → 均质打破细胞 → 抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。 纯度1% (2) 部分纯化 : 初步的纯化，使用各钟 色谱层析法。 纯度50%-90% (3) 均质酶蛋白 : 目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。 纯度99% 分离纯化不同阶段 5 酶的组合分离纯化策略 纯化方案的评价 （1）酶活力 酶催化某一化学反应的能力。一般用单位时间内产物生成的量来表示酶催化的反应速率 。 （2）比活力=活力单位数/毫克蛋白 比活力越高，酶纯度也越好。 表示酶制剂纯度的一个指标。 模板来自于 * * *