高效液相色谱分析技术—方法认证和注意事项(陈桂良).pptVIP

样品测定 醋酸可的松为标示量的105.3%，盐酸四环素为标示量的96.3%。 测定方法说明 色谱条件的选择 提取方法的选择 注意事项 样品制备 流动相制备 系统维护 样品制备 对于多数分析，样品制备可能仅包括溶解已知重量或体积的样品，稀释到合适的分析浓度等。然而，如果进行柱前衍生化，就需要大量的样品制备工作。柱前衍生化可以提高灵敏度，产生专属性，或者分离光学异构体，以及减少或消除其它复杂昂贵的清除程序。在生物样品的清洁过程中，通常使用合适的固体小柱进行固相萃取。固相小柱也可用于提高痕量被测物的浓度。这些纯化步骤可以通过合适的管路装置在分析过程中完成，通常使用六通阀或十通阀，或者使用计算机控制泵和阀。无论如何处理，都必须注意采取合适的样品进样和制备方式。 流动相及过滤 流动相：有机相应为光学纯或HPLC级；水必须是新鲜的去离子水；其它试剂分析纯或更高。使用前均用相应的滤膜滤过（≤0.45μm） 滤膜：聚四氟乙烯膜-双相；尼龙66膜可过水和大多数有机溶剂；醋酸纤维素滤膜适用于水性溶液（尤其是蛋白质和蛋白质相关样品）；再生纤维素滤膜适用于水溶性生物样品和有机溶剂。 注意：1.水膜和有机滤膜千万不可混用！！！ 　　　　2.分别滤过的水相与有机相的混合。 　　液相常用的溶剂过滤装置 玻璃过 滤头 接头 过滤器 流动相脱气 流动相进入高压泵之前一定要脱气，防止空气在泵中影响流量及进入检测器因压力降低而产生气泡，增加基线噪音减低分析灵敏度。 脱气方式有三种：1.氦气脱气 　　　　　　　　　2.超声波脱气（需超声波加真空泵） 　　　　　　　　　3.真空在线脱气 脱气机G1322A 脱气原理--选择性半透膜 脱气机有四个通道，每个通道的流动相相对固定，这样可避免相互干扰。 每个通道的内体积为12毫升，若更换新流动相，需要用三倍的体积（36毫升）以上过渡才可平衡。 背后有一个REMOTE线，可连接到其它模块的REMOTE接口上，若脱气机漏气可即时通知系 统停止分析（若脱气效果不影响分析可不接）。 脱气机红灯报警: 通常是因为腔体漏气，而非半透膜破裂。可取出腔体，将液体进口处螺帽拧紧（注意：由于 芯子是塑料的，千万不可太用力）。 系统维护 泵和色谱柱应当用50:50的甲醇-水或乙腈-水混合物进行清洗，去除系统中的缓冲盐。泵、进样器和检测器需要有计划的进行周期性维护，确保仪器处于良好的工作状态。检测器应当使用NIST提供的合适校准物质或者来源于NIST的其它物质进行校准。FDA和其它管理机构要求提供关于仪器完好状态的记录文件。因此，与维护工作有关的文档应当保存。如果仪器发生故障，也需要提供额外的文件，以证明测定结果未受影响，或者由于仪器故障而丢弃。 加速稳定性试验 目的能指示产品的降解产物是否干扰活性成份测定，由色谱图和相关保留时间说明之。 色谱峰完整性 分析峰完整性和纯度，可以用其他分析技术证明，如UV方法等也可用二极管阵列检测器扫描检定，取峰顶点、中点和底部三处光谱叠加时应完全重叠。 线性与范围 至少用5个标准液为一组，浓度范围从50～150%，响应与标准浓度（或进样量）成线性关系，线性回归分析其相关数应大于0.999。 精密度(系统精密度和方法精密度） 系统精密度：标准液六次重复进样，测每次响应值（峰面积或峰高),六次响应值,一般RSD﹤2%; 方法精密度：方法精密度（指日内和日间)测定,一般日内RSD ﹤3%,日间RSD﹤5%。 准确度/回收率(模拟处方法和 标准加入法) 模拟处方法:加入已知量药物到空白赋形剂中，至少用三个水平（50~150%）浓度溶液。各个回收率应在理论量±3%以内，全部回收率平均值应在理论量±2%内。 标准加入法:已知量分析样品加到几个样品中, 分析样浓度必须在线性范围内,三批样品制剂, 回收率应在理论量在±3%内,总回收率在±2%内。 耐用性 ⑴ 柱—柱间可变性； ⑵ 分析液稳定性； ⑶ 实验室核对； ⑷ 其他影响因素。 柱—柱间易变性 用同一型号柱和同一制造商的柱但批号不同也应重复专属性试验，至少用一个其他制造商生产的同一类型柱重复专属性试验，然后通过试验要说明哪个牌号的柱是可适用的，哪个牌号是不适用。气相色谱柱可用相同填料的不同批号装第二个柱做专属性进行观察评价。 分析样品溶液的稳定性 分析样品在溶剂中稳定性。允许溶液放在室温下一定时间，然后分析此溶液与新鲜配制标准溶液和样品溶液有何不同，其响应平均值（以峰高或峰面积）与新配制溶液的响应值比较应在±2%内。 实验室内核对 系统精密度，方法精密度和专属性试验必须由另一分析者在另一仪器上可重复性验证。 其他影响因素 实验条件如避光，pH值或流动相组份比，温度，衍生化反应时间，进样温度等要进行论证评估。 灵敏度 检测限和定量限，在