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比色法测定小儿化毒散中胆红素的含量 　　摘 要 目的：建立小儿化毒散中胆红素的含量测定方法。方法：本实验采用比色法测定胆红素的含量，用重氮化试剂为显色剂，检测波长为533 nm。结果：胆红素浓度在0.010 3～0.050 0 mg/ml范围内与吸收度呈良好的线性关系（r=0.999 8， n=5），平均回收率为99.36% （RSD=0.45， n=6）。结论：该法简便、快速、稳定、可靠，可用于测定小儿化毒散中胆红素的含量。 　　关键词 小儿化毒散 人工牛黄 胆红素 比色法 　　中图分类号：O657.32； R286 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2013）19-0043-03 　　小儿化毒散收载于《中华人民共和国药典》（2010年版I部），由大黄、冰片、人工牛黄、黄连、天花粉、珍珠、赤芍和川贝母等12味药组成，具有清热解毒、活血消肿的功效，用于小儿热毒内蕴、毒邪未尽之口疮肿痛，烦躁口渴，大便秘结等症[1] 。其中人工牛黄含有效成份胆红素，其质量标准中未收载检测方法。为能更好地控制本制剂质量，本文采用比色法对胆红素进行含量测定[2-3]。 　　1 仪器与试药 　　1.1 仪器 　　紫外可见分光光度计（美国Varian公司）；BP211D型电子天平（德国Sartorius公司）；电热恒温水浴锅（江苏南通县通海电器厂）等。 　　1.2 试剂 　　胆红素对照品（中国药品生物制品检定所，批号10077-0101），水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。小儿化毒散（广西南珠制药有限公司，0.6 g/瓶，批号。 　　2 方法与结果 　　2.1 对照品溶液的制备 　　精密称取胆红素对照品10 mg至100 ml棕色量瓶中，加三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 ml至50 ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。 　　2.2 供试品溶液的制备 　　取装量差异项下的内容物，混匀，精密称取15 g装量的样品，置圆底烧瓶中，加三氯甲烷-乙醇（7：3）混合溶液60 ml、盐酸1滴，摇匀，置水浴65 ℃中加热回流30 min，放冷，过滤，置100 ml棕色量瓶中。容器用少量混合溶液洗涤，洗液并入同一量瓶中，加上述混合溶液至刻度，摇匀。精密量取上清液10 ml，置50 ml棕色量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，即得。 　　2.3 测定波长的选择 　　精密量取胆红素对照品2 ml，置具塞试管中，加乙醇至9 ml，精密加入重氮化溶液（甲液：取对氨基苯磺酸0.1 g，加盐酸1.5 ml与蒸馏水适量使成100 ml。乙液：取亚硝酸钠0.5 g，用蒸馏水溶解并稀释至100 ml，置冰箱内保存。临用时取甲液10 ml、乙液0.3 ml混匀）1 ml，摇匀，在15 ℃暗处放1 h，以相应的试剂为空白，扫描，在400～800 nm波长范围内测定吸收光谱。结果胆红素对照品溶液在533 nm波长处有最大吸收峰，故以533 nm为测定波长。 　　2.4 标准曲线的绘制 　　精密量取“2.1”项下对照品溶液1、2、3、4、5 ml，置试管中，分别加乙醇至9 ml， 按“2.3”项下自“精密加入重氮化溶液”起依法操作，相应试剂做空白，在533 nm波长处测定吸光度 ，以吸光度为纵坐标， 浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程： Y =6.441 X +0.006 7， r = 0.999 8。胆红素在0.010 3～0.050 0 mg/ml范围内，浓度与吸光度呈良好的线性关系。 　　2.5 精密度试验 　　取胆红素对照品溶液，按上述方法重复测定6次，测得吸光度分别为：0.124 2、0.124 9、0.123 8、0.124 7、0.124 1和0.123 5 OD，平均值为0.124 2 OD，吸光度的RSD为0.42%。 结果表明，本方法的精密度良好。 　　2.6 稳定性试验 　　取胆红素对照品溶液，分别于配制后0、3、6、9 h，按上述方法测定吸光度，结果表明对照品溶液在9 h之内稳定。 　　2.7 重现性试验 　　分别精密吸取胆红素标准液5 ml 6份，按“2.4”项下操作，测得吸光度分别为：0.328 1、0.328 5、0.328 9、0.327 9、0.327 7和0.327 4 OD，平均值为0.124 2 OD，吸光度的RSD为0.17%。结果表明，此方法有较好的重现性。 　　2.8 加样回收率试验 　　精密称取样品细粉约1瓶总量，精密加入胆红素对照品0.05 mg，置圆底烧瓶中，按“2.2”项下方法制备溶液6份，在533 nm波长处测定其吸光度，计算胆红素平均回收率为99.36%， RSD为0.45% （n=6），结果见表1。 　　2.9 样品测定 　　取小儿化