94实验四培养基的配制及细胞培养的条件..pptVIP

细胞工程实验动物细胞培养部分 实验一培养基的配制及细胞培养的条件 一、实验目的 掌握动物细胞培养基的配制方法，了解细胞培养的条件。 二、实验原理 细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售，它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体内细胞外液相似。小牛血清含有一定的营养成分，更重要的是它含有细胞生长所必须的生长因子、激素、贴附因子等，这是合成培养基所无法替代的。此外它还能中和有毒物质的毒性。故一般体外培养细胞时要加入一定量的小牛血清(10％。20％)。 三、细胞生存的环境与条件 动物细胞在离体的环境下生长，必须具备以下相关的条件： 适宜的温度：体外细胞培养的温度约为36℃～37℃。 pH条件：细胞最适生长的pH为7.2～7.4。　 气体条件：培养中需要二氧化碳气。 基本营养条件：细胞培养的培养基必须供给活细胞所需要的全部盐类、氨基酸、脂肪、糖类、维生素等。细胞的培养基可分为天然培养基和合成培养基。 渗透压：培养基的物质浓度需使细胞保持等渗状态。 生长刺激因子 无菌环境 四、培养基的分类 1．天然培养基（小牛血清、胚胎液） 天然培养基是最早期人们采用的细胞培养基，直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，但成分复杂，而且不稳定，来源也受到限制，不宜大量培养和生产使用。水解乳蛋白和胶原是两种较好的天然培养基，富含氨基酸。血清是天然培养基中最有效和最常用的培养基，有些成分功能明确，另外一些成分功能不明确。血清的来源有胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用的为胎牛血清和新生牛血清。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。 四、培养基的分类 2．合成培养基（化学成分清楚） 合成培养基是用化学成分明确的试剂配制的培养基，组分稳定，可大量供应。合成培养基发展至今已有几十种，大部分已商品化。由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成培养基也不同，在动物细胞培养中最常用培养基7－8种，如BME、MEM、DMEM、IMEM、HAM F12、PRMI1640、M199等。?????? 由于天然培养基的一些成分仍然不清楚，不能用已知的化学成分代替，因此必需在合成培养基中添加5％~10％的小牛血清。在杂交瘤培养中，要求更严格，添加浓度更高，一般为10％～20％的胎牛血清。血清的加入对培养非常有效，但对培养产物的分离纯化和检测会组成一定的不便。 四、培养基的分类 3．无血清培养基 无血清培养基（serum free medium, SFM）是全部用已知成分组配的不加血清的合成培养基，通常在含有细胞所需营养和贴壁因子的基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子，保证细胞良好生长，是最适合于制药生产的培养基。它提高了培养的质量，避免了使用血清带来的麻烦：血清中某些细胞毒性成分，血清中存在病毒、真菌、支原体等微生物污染的危险，血清中蛋白对产物蛋白测定的干扰。产品纯化容易，组分稳定，可大量配制。已有各种无血清培养基上市。???? ? 一些合成培养液可以作为无血清培养液的基础，如CMRL 1060、TC199、IMDM、McCoy 5a、Ham’s F10和F12。已有其他商品化的无血清培养液，如淋巴细胞无血清培养基、内皮细胞无血清培养基、杂交瘤细胞无血清培养基、巨噬细胞无血清培养基等。?????? 无血清培养基通常添加生长附加成分，如激素与生长因子、低分子营养成分和转铁蛋白等，主要包括胰岛素、孕酮、硒酸钠、腐胺、转铁蛋白。对于大规模生产用的无血清培养基，往往成分不完全清楚，但简单而且低成本。 五、实验用品 1、仪器与用品：超净工作台、高压灭菌锅、滤泵(进口)、滤器(进口)、纯水机（进口）、200mL烧杯、100mL配液瓶、翻帽塞、饭盒、孔径0．22 μm的微孔滤膜、10ml或50ml一次性注射器。 2、试剂：合成培养基(RPMI1640或DMEM)，纯水，NaHC03，青霉素，链霉素，小牛血清。 六、实验步骤 (一)准备和安装过滤器 清洗好过滤器，干燥，放入一张孔径0．22μm的微孔滤膜，用布包装好，15磅20 min进行高压灭菌处理。 在超净台内打开过滤器架好，胶管一端接入滤泵再插入待除菌的液体中，出口端胶管深入到已消毒好的瓶子中，用滤泵做正压过滤。也可以用一次性注射器加针头滤器过滤，过滤后要检查滤膜是否完好无损。 (二)合成培养基的配制 1．取3 L纯水，纯水最好现取现用。 2．加入合成培养基干粉3袋（1L/袋），使之充分溶解。 3．按包装指示加入一定量NaHCO，充分溶解。 4．加入双抗贮存液(青霉素+