15-色谱法技巧.ppt

二、高效液相色谱法（HPLC） 1.高效液相色谱仪的主要特点 ?与经典液相色谱相比： 分离效能高（40000~60000块塔板/米），分离速度快、色谱柱可反复使用，能在线检测。 ?与气相色谱相比： 优点：高压(104kPa)、高速(1h)、高效、高灵敏度(10-9-10-11g样品量)、几乎可分析各种物质，适用于热不稳定物质的分析； 缺点：没有灵敏度很高的通用检测器，操作运行不容易。 高效液相色谱仪构造 输液泵种类：恒压型和恒流型。 恒压泵可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。 恒流型:溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵。 4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，可在高压下混合。 4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。 在研究制定一个HPLC方法时，选择适宜的流动相是很重要的内容，下图是选择流动相中溶剂的三角形图。 二、固定相载体 由于各种HPLC分离方法的流动相均为液体，因此，HPLC通常是按照固定相载体或固定液的不同来分类的。 1. 按承受压力分 刚性固体：SiO2为基质，耐压为7.0×108~1.0×109 Pa。可制成直径、形状和孔隙深度不同的颗粒；主要用于吸附、分配和键合色谱； 硬 胶：以聚合物为基质(常用苯乙烯与二乙烯苯交联而成)，耐压上限为3.5× 108 Pa, 主要用于离子交换和凝胶渗透色谱（GPC）。 （2）外标法 外标法也称为标准曲线法。 特点及要求： 外标法不使用校正因子，准确性较高， 操作条件变化对结果准确性影响较大。 对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。 （3）内标法 内标物要满足以下要求： （a）试样中不含有该物质； （b）与被测组分性质比较接近； （c）不与试样发生化学反应； （d）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。 试样配制：准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物mS 计算式： 内标法特点 (a) 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。 (b) 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。 (c) 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则： 比较 该法已成为现代分析技术的重要手段之一，目前在化学、化工、医药、生化、环保、农业等科学领域获得广泛的应用。 高效液相色谱仪的结构示意见如右图，一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。 1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2 ?m，可防止颗粒物进入泵内。 2）脱气：脱气的目的是为了防止流动相从高压柱内流出时,释放的气泡进入检测器而使噪声剧增,甚至不能检测。 脱气方法：超声波脱气、真空加热脱气、真空抽滤和氦气脱气。 3）高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。 1. 高压输液系统 马达 往复式拉动 密封 溶剂 球阀 脉动阻 尼器 到色谱柱 机械往复式恒流泵装置示意图 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。 优点：改善峰形；提高柱效；减少分析时间；使强保留组分不容易残留在柱上，因而可保持柱的性能良好。 缺点：在进行下次分析时，更换流动相达到平衡的时间长。 2. 进样系统 进样装置包括两种。 1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。 2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图8-4。 装入样品 出口 进样 采样环 泵入溶剂 进色谱柱 3. 色谱柱 1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为10~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。 液相色谱检测器包括紫外吸收、荧光发射、示差折光和安培检测器等。 1）紫外检测器 其检测原理和UV-Vis方法一样。只是此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm, 体积约为1~10 ?L。 HPLC分析中，约有80