《ELISA试剂盒实验教程.ppt

结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 3.2.4　结合物的保存 酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 3.2.5 　结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 试剂准备 C 酶的底物 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 3.3 　酶的底物 3.3.1 　HRP的底物 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中， DH2为供氧体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。 DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。 E Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 3.5 　酶反应终止液 　　常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile . Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 4 对照设定 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组