生物治疗试验方法学.docVIP

肿瘤生物治疗实验室常用实验方法 总RNA的提取（Trizol法提取） 在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。 提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；贴壁细胞可直接弃培养基后加Trizol裂解； 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟； 在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟； 取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟； 弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清； 让沉淀的RNA在室温下自然干燥；(RNA沉淀在70%乙醇中可长期保存) 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。 PCR 实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和PyrobestTM DNA Polymerase。TaKaRa TaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。 按下列组成在PCR反应管中调制反应液： TaKaRa TaqTM或TaKaRa EXTaqTM的配方 Reagent Quantity, for 50μl of reaction mixture 10X PCR buffer （Mg2+ free） 5 μl MgCl2（25mM） 如TaKaRa TaqTM加3 μl 如TaKaRa EXTaqTM加4 μl 2.5mM dNTP mix 4 μl 10μM Primer 上游 1 μl 10μM Primer下游 1 μl Template DNA 1 μl Taq或EXTaqDNA Polymerase 0.25 μl Sterile deionized water Up to 50μl Total 50 μl /Sample PyrobestTM DNA Polymerase的配方 Reagent Quantity, for 50μl of reaction mixture 10X Pyrobest buffer 5μl 2.5mM dNTP mix 4μl 10μM Primer上游 1μl 10μM Primer 下游 1μl Template DNA 1μl PyrobestTM DNA Polymerase 0.25μl Sterile deionized water Up to 50μl Total 50μl /Sample 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50μl（25UL）以节约试剂； 将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中； 如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30 ~50μl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发； 按以下程序进行PCR扩增。 PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。 Step Temperature, °C Time, min Number of cycles Note 起始变性 94~95 1-3 1 变性 94~95 0.5-2 25-35 退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化 退火 37-70 0.5-2 延伸 70-75 根据扩增产物的大小 每分钟延伸1000bp 最终延伸 70-75 10 1 反应结束后，抽取扩增样品5