《分子标记原理和技术.ppt

DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。 240 16 256 ７ 114 52 22 8 2 0 0 短片段（单链) 14 12 10 8 6 4 2 长片段（单链) 128 64 32 16 ８ ４ ２ 总片段（单链) ６ ５ ４ ３ ２ １ ０ 循环数 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 预变性 (92-95?C,2-5m) 变性 (92-95?C,30s) 复性 (40-60?C,30s) 延伸(72?C,30-60s) 总延伸(72?C,7m) (25-35) PCR的一般过程 经过30次循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. ? PCR产物的积累规律 DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。 反应初期，目的DNA片段呈指数形式（2n）增加，随着目的DNA的积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和——平台期 。（25个循环） Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. ? PCR反应的自动化 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. ? PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ ? Taq DNA聚合酶 来源：水生栖热菌 Thermus aquaticus 特性：良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能？ Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 1.3.2 PCR引物设计 ? 引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ? 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长 10kb的片段。 ? 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ? 避免引物内部出现二级结构，避免两引物间互补，特别是3’端互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异扩增条带. ? 引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 ? 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ? 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 1.3.3 模板的制备 DNA ? 从细胞中提取DNA： 动、植物细胞、绒毛、尿样、毛发、口腔上皮细胞等 ? 固定和包埋的组织标本： 脱蜡、蛋白酶K消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 1.3.4 PCR的基本反应 ? 以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 　 10 ?l 4种dNTP混合物 　 各20 ?mol 引物 　　　　 　 各10～100 pmol 模板DNA 　　　 0.1～2 ?g Taq DNA聚