PCR技术及其应用-11.ppt

PCR技术及其应用 PCR的定义： PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。 聚合酶链式反应于1983年由美国科学家 K.Mullis建立，荣获1993年度诺贝尔化学奖， 为生命科学领域的研究开创了崭新时代。 PCR技术原理 Target Amplification 实验仪器 实验结果 增效PCR（booster PCR） 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增，消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成引物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15～20个循环后补充产物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。 在同一PCR体系中加入数对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。 原位PCR技术 原位PCR Hasse等于1990年建立。 是指在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点。 原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，分子水平和细胞水平研究并重。 原位PCR的实验过程：  实验用的标本是新鲜组织、石蜡包埋组织、脱落细胞、血细胞等。其基本方法为多聚甲醛固定组织或细胞，蛋白酶消化处理组织；在组织细胞玻片上滴加PCR反应液进行扩增，覆盖并加液体石蜡后，在原位PCR仪上进行PCR循环扩增，PCR扩增结束后用标记的探针进行原位杂交，最后显微镜观察结果。  16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 反转录PCR技术 常规PCR方法的局限性分析： 无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析 必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒 无法对扩增反应实时检测 实时荧光定量PCR （real-time PCR） 非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA binding dyes） SYBR? Green I SYBR? Gold Ethidium Bromide DNA binding dyes 非特异性的嵌入荧光染料评价 优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物 缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引 物和非特异性扩增产物结合，不能真 实反映目 的基因的扩增情况。 TaqMan 探针 评价 优点： 荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测 缺点：比DNA结合染料价格高 Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory Ct值 （Threshold Cycle） PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。 实时荧光定量 PCR技术的应用 1. DNA 或 RNA 的绝对定量分析 。包括 病原微生物或病毒含量的检测 , 转基因动植物转基因拷贝数的检测， RNAi 基因失活率的检测等。 2. 基因表达差异分析。例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证 3. 基因分型。例如 SNP 检测，甲基化检测等。 PCR技术的主要用途 1、目的基因的克隆： 　　PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基 　　因片段提供了简便快速的方法。 2、基因的体外突变： 　　　　可以随意设计引物在体外对目的基因片段 　　进行嵌和、缺失、点突变等改造。 3、DNA序列测定： 　　　PCR技术的引入使DNA测序工作大大简化， 　也提高了测序的速度。 4、基因突变分析： 　　　利用PCR与一些技术的结合可以大大提高 　基因突变检测的敏感性。 5、DNA和RNA的微量分析： 　　　PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量 　要求很低，是DNA和Ｒ