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real-time PCR 实时荧光定量PCR技术原理 real-time PCR 实时荧光定量PCR技术原理 原理：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。 荧光标记：两类：荧光探针和荧光染料 目前主要有五种，分别是：DNA结合染色，荧光标记引物，水解探针，分子信标，杂交探针 又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类 SYBR Green I 荧光染料 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料 游离弱荧光，插入双链DNA强荧光 延伸结束采集荧光信号 优点：无需特异标记 缺点：存在非特异（杂带）荧光 结束时做解离曲线 Taqman水解探针 FRET原理 利用Taq酶Taq酶的5′-3′外切酶活性 间接法 分子信标 FRET原理 直接法 双杂交探针 FRET原理 淬灭型：与产物量成反比 激发型：与产物量成正比 Ct 值 C代表Cycle，t代表threshold， 定义：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 Thanks ? * 绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数 ??标准曲线法 相对定量是确定经过不同处理的样本之间基因的表达差异 ??2 -△C（t） ??双标准曲线法 两种定量的不同方法 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?PCR的产物 绝对定量通过标准品定量 *
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