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反相高效液相色谱reversed-phase high-performance liquid chromatography 高效液相的简介 概念：高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 发展历史： 1906年俄国植物化学家茨维特（Tswett）首次提出“色谱法”（Chromotography）和“ 色谱图”（Chromatogram）的概念。 1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。 1952年，英国学者Martin和Synge提出了关于气－液分配色谱的比较完整的理论和方法 。 1958年，基于Moore和Stein的工作，离子交换色谱的仪器化导致了氨基酸分析仪的出现，这是近代液相色谱的一个重要尝试，但分离效率尚不理想 。 1960年中后期，气相色谱理论和实践发展，以及机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC 。 1970年中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化水平和分析精度 。 1990年以后，生物工程和生命科学在国际和国内的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，如人类基因组计划，蛋白质组学有HPLC作预分离等 。 HPLC特点： 高效液相色谱法有“四高一广”的特点 ： ①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压 ②高速：分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时 ③高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍 ④高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在μL数量级 ⑤应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势 HPLC分类：按照分离机理的不同，可分为以下几类 HPLC 液液分配色谱法中的化学键合固定相：目前广泛使用的化学键合固定相是将固定液的官能团键合在载体上而制成的，使用化学键合固定相的色谱方法(简称键合相色谱法)可以用分配色谱的原理加以解释。键合相色谱法在HPLC中占有极其重要的地位，是应用最广的色谱法。按照固定相和流动相极性的不同，分配色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法两类。 分配色谱法 高效液相色谱的结构及原理 钙调蛋白肽段的反相HPLC分离实验 实验仪器和试剂： 仪器： 反相高效液相色谱仪 离心机 试剂： 乙腈 水 0.1%TFA溶剂 钙调蛋白 消化酶 实验步骤： 1、打开HPLC，设定所需数值，如：波长（210nm），流动相流量和比例（乙腈5%到70%v/v梯度） 2、样品处理：样品消化，真空离心浓缩 3、待基线平衡和压力稳定后，注射进样 4、收集与监测器上出现的吸收峰相对应的组分 实验结果： 实验注意事项： 1、蛋白质是具有边缘疏水性的偶极离子，因此色谱柱必须是带有芳族或者脂族的硅胶 2、RP-HPLC要用有机溶剂来分离分子，此类溶剂会破坏蛋白质的三维结构，因此此种方法只适合用来分离制备化学分析用的蛋白质或者蛋白片段 3、分离钙调蛋白肽段的色谱柱要选择C8柱 4、要在低波长（210nm）下监测 5、样品需用TFA 稀释 * 1、吸附色谱法(adsorptionchromatography） ：以吸附剂为固定相的色谱 2、液-液分配色谱法(liquid-liquidchromatography) ：液-液分配色谱的固定相和流动相是互不相溶的两种溶剂，分离时，组分溶入两相，不同的组分因分配系数(K)的不同而被分离 3、离子交换色谱法(ionexchangechromatography)：以离子交换剂为固定相的色谱方法，组分因和离子交换剂亲 4、空间排斥色谱法(stericexclusionchromatography)：空间排斥色谱也称为凝胶色谱。其固定相是具有一定孔径范围的多孔性物质，即凝胶。被分离组分因分子空间尺寸大小的不同而被分离 5、亲