微生物生态学课程作业.doc

使用 Illumina MiSeq平台通过多通道16s rRNA测定减少错误的鉴定 DNA测序的费用由于下一代测序技术的进步而降低了。通过Illumina MiSeq平台可以测得大量的序列，而且测序的费用远比454磷酸测序法低。但是也存在一些问题：大量序列的分析以及需要减少3’端错误的序列。这些错误可能导致对微生物群落的错误鉴定。因此准确的分类识别要求我们必须减少这些错误的序列。已经有一些研究通过Illumina MiSeq构建宏基因组提高通道来增加准确性。在本文中我们会评估通过Misep平台使用250bp配对序列进行微生物鉴定的错误率以及如何通过提高通量来减少错误的鉴定。我们比较了不同条件：改变phix的添加量、改变基因库的大小、通过已知序列选择不同的16sRna基因区域。我们得到的方法可以纠正错误的核苷酸和提高识别精度。总体上来说99.5%的所测序列与相应的序列有着95%的相似性，而且93.6%的所测序列与相应序列有97%以上相似度。这表明MiSeq平台在基因水平分析微生物群体具有高准确性。改进后的方法可以应用于多种环境下通过Misep平台获得大量序列。 关键词:16s RNA基因；Misep；鉴定 1 简介 下一代测序技术已经广泛应用在不同环境微生物的研究中而且提供了这些微生物大量的信息。人们已经开始应用16s rRNA来分析微生物的生物学种类，16S rRNA是细菌和真菌的特征因子。454焦磷酸测序技术由于他可以测得较长序列而在微生物鉴定中得到了广泛的应用。然而,最近,Illumina公司和IonTorrent平台在微生物测定的应用越来越被多。Illumina公司平台可以测得大量的序列;然而,它的长度相对较短的序列对微生物群落的研究是是一个约束。这个限制可以通过Misep平台延生配对序列到250bp或者300bp得到解决。更长的序列可以对微生物进行更准确的分类。所以Illumina公司平台现在可以应用无微生物群落研究。此外，使用Illumina公司平台得到的大量序列可以减少成本和增加每个样品的研究深度。 将MiSeq平台应用于微生物群落研究需要生物信息学的发展来处理大量的配对序列。一些研究已经对Illumina公司平台获得的基本序列进行了不同方式的分析。在一些研究中，通过大量序列的检测对β多样性进行分析。在另一些研究中,通过质量分数来对获得的序列进行删减。众所周知Illumina公司平台在测序反应中会产生错误，改正这些错误的防范也已经有过相关的报道。此外由于PCR扩增漂移、非特异性引物杂交、较低的退火温度和模板再次退火也会产生诸如二元序列和PCR偏移等错误序列。修正这些错误的序列对于准确的环境微生物群落的分析是必须的。重叠片段中不配对序列的改正方法已经有人提出。但是这种方法不能改正非重叠区域出现的错误序列。使用250bp配对的Misep平台，对虚拟序列样品的重新检测和对这些序列的收集可以减少总体错误率。不幸的是,在删除嵌合体和错误序列后在V4和V5序列得到了98 - 271操作分类单元，而原来只有20个分类操作单元。这样会导致对微生物群落的错误鉴定。因此，改善方法，在最终序列中减少错误的测序要求我们使用Misep平台对微生物群落进行准确的分析。 在16S rRNA中有九个变异度高的区域，这些区域对于不同微生物有着很好的区别能力。然而没有研究证明那个区域对于微生物鉴定来说是最好的，而且对于不同样品的研究会针对不同的区域。比起DNA提取和PCR偏移来说，群落的鉴定更受这些区域的影响。这些区域在使用Misep平台增加序列长度对群落进行研究时同样重要。在以前的研究中，人们对不同区域在100bp和150bp配对序列上用Misep平台进行了研究。V6和V3区域在100bp长度上进行了研究，V3/V4和V4/V5区域在150bp长度上进行了研究，还有一个研究针对V3/V4、V4和V4/V5区域。 在这篇文章中，我们通过改善对16S RNA的分析方法来减少错误的鉴定。此外，我们会比较不同的变化区域来确定使用Misep平台时的最佳区域，还会确定Phix（醋酸苯基汞）的最佳百分比以及测序库的最佳浓度。改进后的方法对于未来使用Misep平台对微生物群落鉴定将会非常有帮助。 2 材料和方法 制备虚拟序列库和DNA的提取 虚拟数据库由以前从猪粪便中得到的47个已知序列的克隆体组成，这47个克隆体和序列在表1中给出。质粒DNA在47个克隆体中用质粒提取试剂盒提取并配成不同的浓度。提取的DNA浓度用DNA浓度分析盒确定。为了评估改进后的方法和生物分类过程，从猪基因样本中提取粪便基因。猪基因样本由韩国动物研究远提供，我们得到了相关的使用权。 扩增子库的测序 通过硅片测试对不同区域结合后的序列进行分析从而确定扩增子测序，在这个测试中，每个引物得到的