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IMAU, Huo XW 第五讲 基因重组与基因工程 Recombinant DNA Technique and Genetic Engineering DNA片段的连接 重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成。相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种: 一、连接方式(一)相同粘性末端的连接 来源: 相同的酶 同尾酶 问题: 极性有两种可能 同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。 (二)平头末端的连接 粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接。 提高连接效率的方法: 加大酶用量(10倍) 加大平头末端底物的浓度 加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用 加入单价阳离子, 150-200mM NaCl 提高反应温度 平头连接同样存在两种极性 (三)不同粘性末端的连接 突出5末端 Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接 突出3末端 T4-DNApol切平,然后平头连接 突出末端不同 Klenow补平,或S1核酸酶切平 连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点。XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点) (四)人工粘性末端的连接 5‘突出的末端 外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化。目的是:不使酶切位点遭受破坏。 3’突出的末端 外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接 平头末端可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳。这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段 (五)粘端与平端的连接 linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段。 – 连接的效率较高 – 酶切时可能破坏DNA分子的完整。 adaptor:人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。 (六)粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 – BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端。这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 。 – 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI 二、重组率 重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为25-75% 提高重组率的方法: 连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化。 载体除磷 (磷酸酯酶5’除磷)。 TdT在3’端增加人工粘性末端,防止载体自我环化 。 1. ?噬菌体(phage) ?噬菌体为线状双链DNA分子,长度约为49Kb,在?DNA分子的两端各有12个碱基的单链互补黏性末端,当?噬菌体进入细菌细胞后,其DNA可迅速通过粘性末端配对而成双链环状的DNA分子,这种由粘性末端结合形成的双链区域称为cos位点(cohesive endsite)。 选用?噬菌体作为构建克隆载体材料的依据 (1)?噬菌体是一种温和?噬菌体,对大肠杆菌具有很高的感染能力,容易保存,可进行大量增殖。 (2)能承载较大的外源DNA片断。野生型?噬菌体头部容许包装?DNA分子大小75%-105%的DNA片断,约36.4-51Kb,而且20Kb的区域对?噬菌体的生长是不需要的,可以缺失或被外源DNA片断取代。 (3)在?DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点,便于多种外源DNA酶切片断的克隆。 2. 粘粒(cosmid) 特征 (1)构建的cosmid克隆载体是一种环形双链DNA分子,其大小不超过36.4kb,一般在10kb以下。 (2)具有质粒的性质,可以承载外源DNA片断,转化大肠杆菌受体细胞,并在大肠杆菌细胞内复制和增殖。 (3)含有 cos位点,提供体外包装必需的cos末端。 (4)构建的cosmid克隆载体较小,但能承载比较大的外源DNA片断,约40kb左右的外源DNA片断。 感受态细胞(Competent cells):
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